3种临床消毒剂杀菌效果和皮肤刺激性的比较研究

武昌俊 蔡 标 童 琳 李 舜 戴陈伟 王 超 周秀红

目前，医院常见的致病菌为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌以及铜绿假单胞菌等。金黄色葡萄球菌属革兰氏阳性菌，能引起组织器官脓肿和手术创伤化脓[1]。大肠杆菌为革兰氏阴性菌，能导致急性胃肠炎和腹泻症状的发生[2]。白色念珠菌属真菌类，通过感染人体和在人体内增殖，形成侵袭性真菌感染，导致患者严重感染甚至死亡[3]。铜绿假单胞菌属革兰阴性菌，是一种条件致病菌，能引起皮肤、软组织和呼吸道感染，以及菌血症等疾病[4]。而医院消毒灭菌工作是提高医疗护理质量的前提和保障，是预防院内感染的重要手段之一[5]。目前，消毒剂已被广泛应用于医院的常规消毒灭菌工作中[6]。消毒剂是指能够杀灭或抑制传播媒介中的病原微生物的制剂，能够切断传染病的传播途径，达到控制传染病的目的[7]。目前，医院医用消毒剂有多种，但作用原理和杀菌效果大不相同。随着消毒剂的频繁使用，抗药菌株不断出现，需要定期评价不同消毒剂的消毒效果。本研究比较临床上常用3种消毒剂的杀菌效果和皮肤刺激性，并进行相关实验研究，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验用消毒剂 含乙醇75.4 %的无色透明液体，pH值为6.5；含有效碘0.51 %的棕色液体，pH值为2.8；含三氯生0.18 %的无色透明液体，pH值为7.4。

1.1.2 实验菌株 大肠杆菌(ATCC 8099)、金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)、白色念珠菌(ATCC 10231)、铜绿假单胞菌(ATCC 15442)购自安徽艾浮地艾空气净化检测站，来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心。

1.1.3 实验动物 多次皮肤刺激实验选用健康豚鼠18只，体质量为250～300 g，随机分为3组，每种消毒剂选用1组进行实验。动物来源：南京安立默科技有限公司，动物合格证号：NO.0032009。动物饲养环境为室温18～28 ℃，相对湿度为40 %～70 %。

1.1.4 培养基 营养琼脂培养基(用于培养金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌)、沙氏培养基(用于培养白色念珠菌)，均购自北京陆桥技术股份有限公司。

1.1.5 中和剂 细菌杀灭实验选用中和剂为1 %(W/V)卵磷脂+1 %(W/V)吐温80的0.03 mol/L 磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)(乙醇)；含1 %(W/V)硫代硫酸钠+1 %(W/V)卵磷脂+1 %(W/V)吐温80的0.03 mol/L PBS溶液(碘伏)；含0.3 %(W/V)硫代硫酸钠+2 %(W/V)吐温80+0.5 %(W/V)卵磷脂的0.03 mol/L PBS溶液(三氯生)。有机干扰物为30 g/L牛血清白蛋白。

1.2 供试菌株的活化 接种供试菌株大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和铜绿假单胞菌至相应的琼脂试管斜面培养基上，置生化培养箱中37 ℃需氧培养24 h。每个菌种各取2支斜面供实验用，其余冷藏备用。

1.3 菌悬液的制备 分别挑取大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和铜绿假单胞菌斜面菌落接种至相应的琼脂平板，置生化培养箱中37 ℃需氧培养24 h至对数生长期，无菌生理盐水洗脱菌落，分别制成菌液浓度为107～108cfu/mL的菌悬液，备用。

1.4 中和剂鉴定实验 实验选择金黄色葡萄球菌(细菌)和白色念珠菌(真菌)进行中和剂鉴定实验[8]。实验分为6组：第1组为消毒剂+菌悬液，第2组为(消毒剂+菌悬液)+中和剂，第3组为中和剂+菌悬液，第4组为(消毒剂+中和剂)+菌悬液，第5组为稀释液+菌悬液，第6组为稀释液+培养基+中和剂。具体实验步骤按《消毒技术规范》卫生部2002版中悬液定量杀菌实验程序[8]进行。第6组平板菌落数应为0；第1组平板菌落数应为0，或仅有极少；第2组平板菌落数应比第1组多，但应比第3、4、5组少；第3、4、5组组间菌落数误差率应≤15 %，组间菌落数误差率按下式计算。重复实验3次，均符合要求时，判定所选中和剂及其浓度为受试样品杀菌实验适宜的中和剂。

1.5 悬液定量杀菌实验 在无菌试管内分别加入0.5 mL菌悬液和0.5 mL有机干扰物溶液，再加入受试消毒剂杀菌工作浓度1.25倍的消毒剂(阳性对照为胰蛋白胨生理盐水溶液)，快速混匀。分别作用至设定时间，取混合液0.5 mL加至装有4.5 mL中和剂溶液的试管内，混匀作用10 min，中和杀菌反应。选取稀释液+中和剂+培养基作为阴性对照，37 ℃培养48 h，实验于19～21 ℃水浴条件下进行，重复上述所有实验步骤3次。观察实验结果，稀释涂平板并计算各组的菌浓度(cfu/mL)，换算成对数值，杀灭对数值[8]按下式计算：平均杀灭对数值=阳性对照组平均菌浓度对数值-实验组平均菌浓度对数值。

1.6 多次皮肤刺激实验 取皮肤正常完好的健康白色豚鼠6只，实验前24 h背脊部两侧各约3 cm×3 cm备皮。将受试消毒液原液均匀涂在一侧脱毛皮区，无刺激性塑料膜覆盖表面，无刺激性胶布和绷带加以固定，另一侧脱毛皮区无处理，作为阴性对照。4 h后温水洗净残留消毒剂。每天实验处理1次，连续实验14 d。在每次实验后24 h观察皮肤刺激反应并进行评分。评分方法与刺激指数计算方法参照《消毒技术规范》[8]，见表1、2。

表1 皮肤刺激反应的评分标准

表2 皮肤刺激强度分级表

按下列公式计算每天每只动物平均积分(刺激指数)，并以表2判定皮肤刺激强度。每天每只动物平均积分为每只动物14 d的红斑和水肿总积分/(受试动物数×天数)。

2 结果

2.1 中和剂鉴定实验结果 细菌繁殖体以金黄色葡萄球菌作为实验菌。第1、6组平板菌落数为0；第2组平板菌落数比第1组多，但比第3、4、5组少；第3、4、5组组间菌落数误差率分别为6.40 %、4.00 %、5.23 %，乙醇第3、4、5实验组间菌落数误差率差异无统计学意义(P=1.000)、碘伏第3、4、5实验组间菌落数误差率差异无统计学意义(P=1.000)、三氯生第3、4、5实验组间菌落数误差率差异无统计学意义(P=1.000)。见表3。

表3 3种消毒剂中和剂鉴定实验(以金黄色葡萄球菌作为实验菌)生长菌落数结果

真菌以白色念珠菌作为实验菌。第1、6组平板菌落数为0；第2组平板菌落数比第1组多，但比第3、4、5组少；第3、4、5组组间菌落数误差率分别为12.90 %、8.61 %、8.31 %，乙醇第3、4、5实验组间菌落数误差率差异无统计学意义(P=1.000)、碘伏第3、4、5实验组间菌落数误差率差异无统计学意义(P=1.000)、三氯生第3、4、5实验组间菌落数误差率差异无统计学意义(P=1.000)。见表4。

表4 3种消毒剂中和剂鉴定实验(以白色念珠菌作为实验菌)生长菌落数结果

2.2 3种消毒剂悬液定量杀灭实验结果 作用0.5、1 min时，三氯生对金黄色葡萄球菌杀灭效果最佳，作用1.5 min时，乙醇杀灭效果最佳；同一时间点3种消毒剂效果差异有统计学意义(P<0.05)。作用0.5、1 min时，三氯生对大肠杆菌杀灭效果最佳，且3种消毒剂杀灭效果差异有统计学意义(P<0.05)；作用1.5 min时，乙醇杀灭效果最佳，但3种消毒剂杀灭效果差异无统计学意义(P>0.05)。作用0.5、1、1.5 min乙醇对铜绿假单胞菌、白色念珠菌杀灭效果最佳，且3种消毒剂杀灭效果差异有统计学意义(P<0.05)。3种消毒剂中，三氯生对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌杀灭效果最好；乙醇对铜绿假单胞菌和白色念珠菌杀灭效果最好。见表5。

表5 3种消毒剂悬液定量杀菌实验平均杀灭对数值结果

2.3 多次皮肤刺激实验结果 3种消毒剂原液连续对豚鼠完整皮肤涂抹14 d后，未见皮肤红斑、水肿等异常反应，其皮肤刺激性指数为0，对豚鼠皮肤为无刺激性。

3 讨论

乙醇是医院最常用的一类消毒剂，医用乙醇为无色澄清溶液，75 %的乙醇溶液杀菌性能最强，但有较大刺激性气味，少数人如老人、儿童可能会产生不耐受性和过敏反应。有研究[9]表明乙醇浓度受温度的影响较大，冬夏季温差较大，配制医用乙醇时一般不宜选用。碘伏是目前我国医院消毒和家庭常用的一类皮肤用消毒剂。碘伏又名聚维酮碘，是有效碘与一类表面活性剂聚维酮相结合而形成的一种络合物[10]。碘伏毒性低，具有广谱的抗菌杀菌作用，对皮肤黏膜无刺激。有研究[11]表明使用碘伏对志愿者前臂内侧中段皮肤表面擦拭消毒后，对皮肤表面自然菌杀灭效果符合我国消毒规范要求。三氯生学名为二氯苯氧氯酚，分子式C2H7Cl3O2，被广泛应用于卫生香皂、消毒洗手液、伤口消毒喷雾剂等消毒领域[12]。

本研究结果显示，作用1.5 min时，乙醇对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌杀灭效果最佳；作用0.5、1及1.5 min时，乙醇对铜绿假单胞菌、白色念珠菌杀灭效果最佳，且3种消毒剂杀灭效果差异有统计学意义(P<0.05)。表明乙醇对革兰氏阳性菌、阴性菌和真菌杀灭效果较好，对细菌繁殖体和真菌具有良好的杀灭性能，杀菌谱较宽。作用0.5、1 min时，三氯生对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌杀灭效果最佳，且同一时间点3种消毒剂杀灭效果差异有统计学意义(P<0.05)，但对铜绿假单胞菌和白色念珠菌杀灭效果相对较差，表明三氯生对革兰氏阳性菌和部分阴性菌灭效果快速高效，对真菌杀灭性能较差，杀菌谱较窄。

在本研究中，多次皮肤刺激实验结果显示3种临床消毒剂多次皮肤刺激性指数为0，刺激反应强度均为无刺激性，对人体安全无刺激。但在临床使用时，应注意老人和儿童对75 %乙醇刺激性气味的不耐受以及少数过敏体质人群使用乙醇消毒时产生的过敏反应。另外，乙醇易挥发，浓度受温度的影响较大，杀菌效果也会受到影响，尽量做到现配先用，随用随配。目前，张鹏等[13]认为高浓度的三氯生能直接或间接影响人类的健康，但有研究[14]表明三氯生对于人类健康影响的研究不足，目前还缺乏对人体有效的安全评价的科学依据。所以，在临床上使用三氯生消毒剂进行消毒时，应尽量配制低浓度的三氯生溶液，一般不超过0.3 %。

综上所述，三氯生对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌杀灭效果最好，乙醇和碘伏对铜绿假单胞菌和白色念珠菌的杀菌效果优于三氯生，临床上应根据患者情况和杀灭对象加以区别选择。