松树蕈多糖磷酸化修饰工艺及其抗氧化活性

季舒婷，谢静茹，赵 培，刘晶晶，陈义勇

（常熟理工学院 生物与食品工程学院，江苏 常熟 215500）

松树蕈（Tricholoma matsutake）又名松蕈、松口菇、松树菌等，隶属担子菌亚门、口菇科、口蘑属［1］.研究发现松树蕈多糖(Polysaccharides from tricholoma matsutake,TMP) 具有抗肿瘤［2］、美白［3］和抗辐射［4］等作用，具有广阔的市场开发前景.分子修饰对多糖活性有很大的影响，对多糖进行化学修饰，可以提高多糖的活性［5］.磷酸化修饰是糖类物质的一种常见的修饰方法，但是目前关于松树蕈多糖修饰研究鲜见报道.本文对TMP磷酸化修饰工艺进行优化，并探讨磷酸化松树蕈多糖( Phosphorylated polysaccharides from tricholoma matsutake，P-TMP）的抗氧化活性，旨在为松树蕈多糖的研究和开发提供理论基础.

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

松树蕈（苏州兴福斋食品科技有限公司提供）；1,1-二苯基-2-苦苯肼、三羟甲基氨基甲烷（上海楷洋生物技术有限公司）；三聚磷酸钠(STPP)、三偏磷酸钠(STMP)、磷酸二氢钾、氯化镁、盐酸、氢氧化钠、无水乙醇、氯仿、正丁醇、丙酮、过氧化氢、维生素C、硫酸、钼酸铵等试剂均为市售分析纯.

1.2 仪器

ME104E型分析天平（瑞士METTLER TOLEDO 公司）；DJ-04粉碎机（上海淀久中药机械制造有限公司生产）；HH-2 智能数显恒温水浴锅（金坛市杰瑞尔电器有限公司）；RE-52A 型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器有限公司）；752型紫外-可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；SHB-B循环水式真空泵（郑州长城科工贸公司）； DHG-9030A 型电热恒温鼓风干燥箱（上海三发科学仪器有限公司）；CR22GⅡ高速冷冻离心机（日本HITACHI公司）.

1.3 实验方法

1.3.1 松树蕈多糖（TMP）的提取

将松树蕈洗净、干燥、粉碎、过60目筛，按料液比1∶40加入蒸馏水，在80 ℃条件下浸提4 h。将多糖提取液离心（4 500 r/min，10 min），取上清液.将上清液减压浓缩至一定体积，加上清浓缩液五分之一体积的Sevage试剂（氯仿与正丁醇的体积比为4∶1，mL/mL）剧烈振荡30 min，去除蛋白，加入4倍体积的95%乙醇，4 °C条件下静置24 h，离心，沉淀经冷冻干燥后得到TMP.

1.3.2 磷酸化松树蕈多糖制备［6］

将多聚磷酸钠与三偏磷酸钠以质量比为 6∶1的比例加入蒸馏水溶解，然后加入10 mL TMP（浓度为0.01 g/mL），调节pH 和温度设定值后进行磷酸化反应，反应完成后，置于截留分子量为3500 Da的透析袋中透析2 d，透析液经减压浓缩后，用4倍95%乙醇醇沉24 h，沉淀经过冷冻干燥，得到磷酸化松树蕈多糖.

1.3.3 磷酸根含量测定［7］

采用钼蓝比色法测多糖中的磷酸根含量，分别取0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5和5.0 mL不同浓度梯度磷酸根标准溶液于25 mL比色管中，依次加入去离子水至总体积5 mL，tris缓冲液、定磷试剂（同体积的20%质量分数Vc、3 mol/L硫酸与3%钼酸铵均匀混合）后置于恒温水浴锅中加热，冷却后于660 nm处测吸光度值为纵坐标，横坐标为磷酸根浓度，绘制磷酸根标准曲线，如图1所示.

图1 磷酸根标准曲线

称取磷酸化松树蕈多糖0.5 g，于600 ℃高温下灰化2 h，加入0.5 mL HCl溶液（蒸馏水与HCl体积比为1∶1），溶解灰化残渣，将灰化样品溶液移入10 mL的容量瓶中定容后，吸取溶液1 mL于25 mL比色管中，按标准曲线绘制方法测得吸光度，根据以下公式计算磷酸根含量.

磷酸根含量=（0.217 5A-0.007 5）/S ×100%

式中，A为样品在660 nm处测得的吸光度，S为样品的质量（g）.

1.3.4 单因素试验

（1）磷酸化试剂比例对磷酸化反应的影响

准确称取松树蕈多糖样品0.5 g，选用三聚磷酸钠与三偏磷酸钠的质量比例分别为6∶1，5∶2，4∶3，3∶4，2∶5，1∶6的磷酸化试剂，在pH6.0、反应温度70 ℃的条件下与多糖反应3 h，考察磷酸化试剂比例对磷酸化反应的影响，确定最佳磷酸化试剂比例.

（2）反应温度对磷酸化反应的影响

准确称取松树蕈多糖样品0.5 g，在pH6.0、温度分别为30，50，70，90，100 ℃的条件下与磷酸化试剂（三聚磷酸钠与三偏磷酸钠的质量比例为5∶2）反应3 h，考察反应温度对磷酸化反应的影响，确定最佳反应温度.

（3）反应pH对磷酸化反应的影响

准确称取松树蕈多糖样品0.5 g，在温度70 ℃、pH分别为5，6，8，9，10，11的条件下与磷酸化试剂（三聚磷酸钠与三偏磷酸钠的质量比例为5∶2）反应3 h，考察反应pH对磷酸化反应的影响，确定最佳反应pH.

（4）反应时间对磷酸化反应的影响

准确称取松树蕈多糖样品0.5 g，在pH9.0、反应温度70 ℃条件下与磷酸化试剂（三聚磷酸钠与三偏磷酸钠的质量比例为5∶2）反应，反应时间分别为2，3，4，5，6 h，考察反应时间对磷酸化反应的影响，确定最佳反应时间.

1.3.5 响应面试验

在上述单因素实验的基础上，以磷酸根含量为指标，磷酸化试剂比例、温度、时间、pH为自变量，根据Box-Benhnken Design中心组合试验设计原理，设计四因素三水平的响应面分析实验，研究磷酸化反应最佳工艺条件.

1.3.6 红外光谱分析

分别取一定量充分干燥的TMP和P-TMP，与一定量KBr充分混匀后压片，在波数4 000～400 cm-1范围内进行红外光谱扫描，比较TMP与P-TMP的红外光谱.

1.3.7 松树蕈多糖的体外抗氧化活性

（1）对DPPH自由基清除作用的测定［8］

分别取不同浓度（20，50，100，150，200 μg/mL）的TMP和P-TMP多糖溶液2 mL，与2 mL 0.1mmol/L DPPH（避光，现配现用）室温混匀，避光反应30 min后，在517 nm处测吸光度.以无水乙醇替代样液作空白对照，按如下公式计算清除率.

DPPH自由基清除率=［1-（Ai-Aj）/Ao］×100%

式中：Ai为多糖样液加DPPH溶液的吸光度；Aj为样液加无水乙醇的吸光度；Ao为乙醇加DPPH溶液的吸光度.

（2）超氧阴离子自由基清除作用的测定［9］

分别取不同浓度（20，50，100，150，200 μg/mL）的TMP和P-TMP多糖溶液1.0 mL置于试管中，加入4.5 mL Tris-HCl缓冲液（50 mmol/L，pH8.2）和3.2 mL蒸馏水摇匀，在25 ℃条件下水浴10 min，然后加入10 mmol/L的0.1 mL邻苯三酚作为样品组，空白组以0.3 mL 10 mmol/L HCI代替邻苯三酚，充分摇匀，反应3 min后（以加入邻苯三酚时开始计时），立即加入1滴10 mol/mL的HCl溶液终止反应，在325 nm处测定吸光度，实验重复3次，按下式计算超氧阴离子自由基的清除率.

式中，A为样品组测得的吸光度，A0为空白组测得的吸光度.

（3）羟基自由基（·OH） 清除作用的测定［10］

分别取不同浓度（20，50，100，150，200 μg/mL）的TMP和P-TMP多糖溶液2 mL，分别加入1 mL FeSO4溶液（9 mmol/L）和2 mL水杨酸-乙醇溶液（9 mmol/L），最后加入2 mL H2O2（8.8 mmol/L）启动反应，在25 ℃条件下反应1 h.用蒸馏水代替样品溶液作空白，在510 nm波长处测定吸光度，实验重复3次，根据以下公式计算羟基自由基的清除率.

其中，A0为标准空白管的吸光度，A1为对照管的吸光度，A2为测定管的吸光度.

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

2.1.1 磷酸化试剂比例对磷酸化反应的影响

图2 磷酸化试剂比例对磷酸根含量的影响

磷酸化试剂比例对磷酸化反应的影响见图2，由图2可知，添加不同比例的磷酸化试剂所得多糖的磷酸根含量明显不同.当磷酸化试剂比为5∶2时，磷酸根含量最高为4.134%.因此选择合适的磷酸化试剂比为5∶2.

2.1.2 温度对磷酸化反应的影响

温度对磷酸化反应的影响见图3，由图3可知，当温度在30～90 ℃之间，随着温度的升高，磷酸根含量不断升高，这可能是因为温度升高使高分子键的活性增强，磷酸化试剂利用率随之增加［11］.当温度达到90 ℃时，磷酸根含量达到最高值为6.618%.当温度继续升高，磷酸根含量反而降低，其原因可能是温度过高会对多糖分子结构造成破坏，使其降解［6］.因此选择合适的反应温度为90 ℃.

图3 温度对磷酸根含量的影响

2.1.3 时间对磷酸化反应的影响

时间对磷酸化反应的影响见图4，从图4可以看出，随着时间的增加，多糖磷酸根含量也不断增加，当时间为5 h时，达到最大值为7.106%.时间进一步增加，磷酸根含量反而下降，可能是因为多糖在较高的温度下反应时间过长，导致多糖降解，从而磷酸根含量减少［6］.因此选择5 h为适宜的反应时间.

图4 时间对磷酸根含量的影响

2.1.4 pH对磷酸化反应的影响

pH对磷酸化反应的影响见图5，由图5可知，当pH为9.0时，磷酸根含量达到最大值7.529%.当pH小于9时，磷酸根含量随着pH的升高而升高.当pH大于9.0时，磷酸根含量随着pH的升高而降低.其原因可能是在较低pH条件下，三聚磷酸钠和三偏磷酸钠不稳定，会分解生成焦磷酸钠和正磷酸钠，使多糖磷酸根含量降低.而pH过高时可能磷酸化试剂和多糖发生酯化反应进而对磷酸化反应产生不利影响［12］.因此选择适宜的pH为9.

图5 pH对磷酸根含量的影响

2.2 响应面优化实验

2.2.1 响应面因素水平的选取及实验设计

在单因素实验结果的基础上，以磷酸化试剂比例（A）、温度（B）、时间（C）、pH（D）为自变量，磷酸化松树蕈多糖中磷酸根含量为响应值，设计四因素三水平的响应面分析试验，探讨自变量与响应值之间的函数关系.试验的因素和水平见表1.

表1 响应面设计因素水平表

2.2.2 模型的建立与分析

松树蕈多糖磷酸化的响应面试验设计及结果见表2，通过使用design-expert软件对表2数据进行拟合，得到松树蕈磷酸化多糖对磷酸化试剂比例（A），温度（B），时间（C）和pH（D）的二次多项回归方程的模型：Y=9.64-0.092A-0.79B+0.073C-0.29D-0.092AB-0.45AC-0.29AD-0.035BC+0.053BD-0.092CD-0.50A2-1.35B2-0.60C2-0.33D2.

表2 松树蕈多糖磷酸化的响应面试验设计及结果

表3 回归方程方差分析结果

响应面分析方差结果见表3.该模型的F值为20.49，P<0.000 1，说明拟合的模型达到极显著的水平；模型的决定系数R2=0.953 5，表明该模型的拟合程度较好，用于评估各因素对松树蕈多糖磷酸根含量的影响较为准确.

从表3还可以看出，试验组合中的各因素中温度（B）、pH（D）均具有极显著水平（P<0.05），其中温度为最大的影响因素.影响程度大小的因素顺序为：温度（B）>pH（D）>磷酸化试剂比例（A）>时间（C）.

2.2.3 响应面图形分析

试验得到的响应面图见图6.在曲面图中，通过图形可以直观地看出因素间的交互作用，坡度越大，影响越显著，反之则影响较小.从图6分析得出，磷酸化试剂比例（A）与温度（C）的交互作用显著，其余交互作用影响不大.

2.2.4 模型的优化及验证实验

通过Design-Expert软件对实验进行优化，按照回归模型预测可得到松树蕈多糖磷酸化的最佳工艺条件为：磷酸化试剂比例为5.03∶1.97，温度为86.98 ℃，时间为5.10 h，pH8.51，在此反应条件下得到的多糖磷酸根含量9.829 9%.为了验证此结果的可行性，根据实际情况修改工艺条件为：磷酸化试剂比例为5∶2，温度86 ℃，时间5.1 h，pH9.0，在该条件下进行3次平行实验测得多糖磷酸根含量平均值为9.703%，该值与模型预测值很接近，验证了该预测试验的可靠性.

图6 两因素交互作用对磷酸根含量的影响

2.3 红外光谱

对TMP及P-TMP在4 000～400 cm-1范围内进行红外光谱扫描，结果如图7所示，可以发现其变化趋势和吸收峰变化不大，都在3 423 cm-1处出现-OH的伸缩振动吸收峰，在2 922 cm-1处出现-CH2的伸缩振动吸收峰，1 619 cm-1出现C=O的振动收缩峰，在1 400处出现吸收峰是因为C-H的伸缩振动.磷酸化后在1 262 cm-1处出现特征吸收峰是P=O伸缩振动产生的，997 cm-1附近的吸收峰是P-O-C的伸缩振动峰，说明磷酸化修饰成功，磷酸化衍生物成功接上磷酸基.

图7 TMP及P-TMP的红外光谱图

2.4 松树蕈多糖抗氧化活性

2.4.1 对DPPH自由基的清除作用

TMP及P-TMP对DPPH自由基的清除作用见图8.由图8可知，TMP及P-TMP都对DPPH自由基具有清除作用，且随着多糖质量浓度的升高，清除能力也随之增强，并呈正相关.与TMP相比，经过磷酸化修饰的多糖P-TMP对DPPH自由基的清除作用明显增强.原因可能是多糖经过磷酸化后其水溶性提高，糖链的构象发生改变，进而影响多糖的生物活性［13］.

图8 TMP及P-TMP对DPPH自由基的清除作用

2.4.2 对超氧阴离子自由基的清除作用

TMP及P-TMP对超氧阴离子自由基的清除作用见图9.由图9可知，在一定浓度范围内，TMP及P-TMP对超氧阴离子自由基均具有清除作用，并且与浓度呈正相关.随着浓度的升高，其清除能力增强.与TMP相比，经过磷酸化修饰的多糖P-TMP清除能力明显减弱，其可能原因是磷酸根基团的存在改变了化合物的极性，从而导致活性的改变.

图9 TMP及P-TMP对超氧阴离子自由基的清除作用

2.4.3 对羟自由基的清除作用

TMP及P-TMP对羟自由基的清除作用如图10所示.由图10可知，TMP及P-TMP对羟自由基都均有较强的清除作用，在一定浓度范围内，随着多糖质量浓度的提高，其清除自由基能力随之增强，P-TMP对清除羟自由基的能力明显强于TMP，其可能原因是TMP经过磷酸化修饰后导致分子结构发生改变，提高了其阻止·OH发生连锁反应的能力.

图10 TMP及P-TMP对羟自由基的清除作用

3 结论

以松树蕈为原料，通过热水浸提法提取松树蕈多糖，以磷酸根含量为指标，探讨磷酸化试剂比例（即三聚磷酸钠与三偏磷酸钠的质量比，g/g）、温度、时间、pH对松树蕈多糖磷酸化修饰的影响.在单因素实验基础上，通过响应面优化松树蕈多糖磷酸化修饰条件，并比较修饰前后松树蕈多糖的抗氧化活性.结果表明：松树蕈磷酸化修饰最佳工艺条件为磷酸化试剂比例5∶2，温度86 ℃，时间5.1 h，pH9.0，在该工艺条件下，磷酸化松树蕈多糖衍生物的磷酸根含量为9.703%.抗氧化结果表明：TMP及P-TMP对DPPH、超氧阴离子自由基、·OH自由基均有一定的清除作用，且在一定质量浓度范围内呈正相关，同TMP相比，P-TMP清除超氧阴离子自由基能力有所下降，但对DPPH及·OH自由基清除能力有所增强.