激光照射GO@lipid可调控磷脂膜形成囊泡或微管研究

刘娇娇

（常熟理工学院 物理与电子工程学院，江苏 常熟 215500）

1 引言

生物膜的形变与许多生理过程密切相关，包括跨膜物质的运输、信号传导、细胞膜的分裂/融合.生物膜的形变不仅依赖于脂质、膜蛋白，还与膜的外部支撑物密切相关，如细胞骨架、细胞外基质或来自细胞外部的物质包括人工组织和纳米医药［1-2］.因此，探索研究脂质与固体支撑物之间的相互作用，特别是膜对支撑物基质的响应，对于理解复杂的细胞活性十分重要［3-6］.

近年来，脂质膜和固体基底之间的界面相互作用，包括通过局部物理环境调节细胞行为，被认为是决定膜组分的纳米级组织和相应功能的关键因素［7-11］.这使得我们可以设计新的具有磷脂纳米结构的材料，这些材料甚至可以模拟一些生物膜行为［12-14］.这些研究为我们提供了关于对细胞生物系统新的理解和应用.在此基础上，石墨烯、氧化石墨烯（GO）、还原氧化石墨烯（rGO）由于其优异的机械性能、电学性能和热学性能引起了广泛关注［15-17］.由于石墨烯材料有良好的生物相容性和独特的共轭结构使其可用于各种生物和医学领域（例如组织工程）［18-21］.想要把石墨烯材料用于生物医药领域，我们需要了解石墨烯材料的细胞毒性和抗微生物能力，石墨烯有这些能力主要是因为石墨烯薄的二维片层结构和表面的疏水性［22-24］.目前关于石墨烯的研究大多集中于石墨烯在生物医药、电学性能等方面的应用.而很少关注到石墨烯材料调节膜形变的能力［25］.

在之前的工作中，我们研究了微凝胶颗粒体积相转变导致的磷脂可逆形变，囊泡释放和融合过程，这清楚地表明支撑物对脂质体自组装行为有强烈影响［26-27］.基于上面这些工作，我们制备了一种新型的复合材料，GO块状聚集体表面修饰一层磷脂膜.在激光照射下，GO还原成了rGO并在此过程中会导致磷脂膜发生形变，磷脂膜表面会形成囊泡和微管.这项工作帮助我们进一步理解膜在固体基底上的转化机制，并为我们设计和合成新型基于GO复合生物纳米材料提供了思路.

2 实验部分

2.1 材料

二油酰磷脂酰胆碱（DOPC）、NBD荧光标记的二棕榈酰磷脂酰乙醇胺（NBD-DPPE），购于Avanti Lipids.GO粉末来自于NanoInnova Technologies.石墨粉、抗坏血酸均购自Sigma公司.乙醇（99%）、氯仿（99.7%）购自上海化学试剂有限公司.

2.2 制备GO，磷脂@GO，磷脂@石墨，磷脂@rGO复合微粒

氧化石墨烯粉末溶解于乙醇中（0.2 mg·mL-1），混合物超声40 min，3 000 rpm离心7 min.然后将下层沉淀物重新分散于乙醇中（0.2 mg·mL-1）为GO聚集体的母液备用.DOPC粉末溶于氯仿（2 mg·mL-1）中，NBD-DPPE粉末也溶于氯仿（0.2 mg·mL-1）中.取100 μL DOPC溶液（加入5 mol%NBD-PE）于小玻璃瓶底部，氮气吹干置于真空干燥箱中过夜，得到有荧光修饰的干磷脂膜.在干磷脂膜中加入40 μL GO母液，60 μL水，几分钟后迅速加入1 mL水，将混合溶液超声30 min（40 W），3 000 rpm，7 min离心3次，洗去多余的磷脂和碎小的GO复合微粒.最后将GO@lipid复合微粒重新分散到400 μL水中，置于实验室自制的共聚焦显微镜观察舱观察.

为了解释在激光照射下复合微粒表面磷脂的形变机理，我们制备了石墨粉、还原氧化石墨烯@磷脂复合颗粒.磷脂@石墨微粒的制备方法同上述的磷脂@GO.磷脂@rGO的制备：DOPC粉末溶于氯仿（2 mg·mL-1）中，NBD-DPPE粉末也溶于氯仿（0.2 mg·mL-1）中，取1 mL DOPC溶液（加入5 mol%NBD-PE）于小玻璃瓶底部，氮气吹干置于真空干燥箱中过夜，得到荧光修饰的干磷脂膜.在磷脂膜中加入400 μL GO（0.2 mg·mL-1），然后加入600 μL的水，紧接着加入1 mL水，每次加入溶液后需将该体系轻轻晃动，以保证磷脂膜完全溶解，溶液混合均匀.而后在该体系中加入1.2 mL，10 mg·mL-1的抗坏血酸水溶液，在37 ℃水浴中轻轻搅拌24 h，此时GO完全还原成rGO［28］.最后将溶液离心清洗两次以洗去多余的磷脂和抗坏血酸，并将所得到的沉淀物磷脂@rGO复合颗粒重新分散于4 mL水中.

2.3 光学显微镜观察囊泡/微管的产生

我们使用的光学显微镜是一个倒置的激光扫描共聚焦显微镜（Zeiss，LSM 710）上的63倍油镜.NBDPE修饰的磷脂使用488 nm的氩离子激光器来激发，发出的光用绿色通道收集.激光照射复合颗粒表面使用的是1.5 mW，5%强度的原位氩离子激光器，照射面积是512×512像素（每个像素1.58 usec）.除了激光强度所有实验保持一致外，另外3个实验条件激光照射区域大小、扫描频率和整体的曝光时间是随着激光照射模式（激光连续照射continuous irradiation和激光间断扫描interval scan）来改变的.因此在样品上可以得到不同的功率密度.

2.4 其他的表征方法

XRD测量时，一定体积的磷脂@GO（磷脂@rGO）溶液离心后，将沉淀物滴在干净的硅片表面.为了解激光照射后GO的还原情况，我们将硅片上的磷脂@GO样品放在共聚焦显微镜下，加入少量水，488 nm 5%的氩离子激光器照射2 h，然后将该溶液晾干，XRD测量表征.

为了测量实验中的温度变化，我们将离心沉淀后的溶液滴到用于温度测量的探头上，并将探头固定在自制的共聚焦显微镜观察玻璃舱中，等探头上的溶液干掉后加入水，然后用共聚焦显微镜的氩离子激光器照射样品，在激光照射的同时统计温度的变化.激光连续照射样品或间隔照射样品GO会释放热量，最终两种模式下溶液达到相同温度.

3 结果及讨论

3.1 GO聚集体和磷脂@GO复合颗粒的结构表征

图1显示了不同尺寸及形态的GO聚集体.聚集体的尺寸大概为5～10 μm，见图1（e），这个尺寸适合直接显微镜观察.GO聚集体不同的形态及结构同时存在.有些聚集体是由片层石墨烯组成，表面是光滑的，如 图 1（a）、图 1（b）所示，其他的复合颗粒则是由很小的GO碎片组成，如 图 1（c）、图 1（d）所示，这种复合体边缘有棱角，不平滑.

GO聚集体表面修饰磷脂前后的TEM如图2所示.与SEM图相比，TEM下可以清楚地看到聚集体的边缘结构，特别是可以看到边缘区域有薄的聚集体.与GO聚集体相比，GO@磷脂上有平行的条纹，条纹间的间隔是3.43 nm.这个间隔远远超过GO片的厚度1 nm［16］，但是很接近空气中磷脂双层膜之间的间距（周期）4.27 nm，并且在多层膜的周期范围内［13］.这样，我们可以推断这个条形的间隔是由磷脂分子在GO表面的自组装形成的，间隔可能是由于层状膜中脂质分子的两亲性结构，见图2（g）.这会在接下来的共聚焦显微镜表征中进一步讨论.

图1 各种不同形态的GO聚集体：（a）（b）表面光滑的复合颗粒；（c）（d）复合颗粒表面有很多GO碎片，（d）中的插图是局部放大；（e）统计了在SEM下106个GO聚集体的尺寸分布

3.2 激光照射下磷脂@GO表面形成囊泡

磷脂@GO复合颗粒在共聚焦显微镜下为绿色（磷脂用NBD-DPPE染色），图3（a）～图3（d）显示了复合颗粒在绿色荧光通道，透射通道及混合通道下的显微镜图.我们可以从图3（e）中看到磷脂分子是均匀分布在整块GO上，这是因为磷脂的自组装在GO表面形成了连续的多层膜.这个磷脂修饰的GO形成多层膜的复合材料在常温下可以存储1 d，在4 ℃下可以存储3 d.

图3（a）～图3（d）lipid@GO复合颗粒形成了不同结构后的共聚焦显微镜图（包括绿色荧光通道，透射通道和混合通道）；（a）～（c）是lipid@GO复合颗粒在激光照射之前的图；（b）～（d）是相同的颗粒激光照射后的图，Scale bar 5 μm；（e）显示了将GO@lipid复合颗粒当作标准的球形在表面形成囊泡后的结构示意图，R代表了整个复合结构的半径，r代表了GO聚集体的半径.

当我们用488 nm的氩离子激光器照射磷脂@复合颗粒表面5.2 μm×5.2 μm的区域，相当于辐射功率为0.055 mW mm2，照射2～5 min的过程中（不同颗粒表面照射时间不同，照射时间长短根据复合颗粒表面荧光什么时候会被激光完全淬灭来选择），复合颗粒会震动并且在溶液中移动（激光照射前复合颗粒是静止的），且磷脂@GO表面有明显的变化.激光照射后复合颗粒表面形成一圈稳定且数量较多的囊泡，同时复合颗粒在透射通道下会变得比激光照射前更暗，见图3（b）、图3（d）.

为了定量统计形成的囊泡的尺寸，我们将最初在共聚焦截面图下观察到的囊泡面积与复合颗粒面积之比定义为φ=（A-B）/A*100%，A代表了整个复合颗粒结构包括表面形成的囊泡，其总面积需要从复合通道中去观察，B代表了GO聚集体的面积，从透射通道中观察，如图3（e）所示.A-B就代表了形成囊泡的区域.我们对12个单独的样品进行统计，包括之前提到的两种类型的GO聚集体（由很多GO碎片构成的四周有棱角的GO聚集体，由整片的GO构成的表面相对平滑的GO聚集体），其中φ计算为5.11±1.5%.如果我们将磷脂@GO，GO聚集体都看作是标准的球形，定义R代表了整个复合结构的半径，r代表了GO聚集体的半径.因此φ=（4πR2-4πr2）/4πR2=0.511，R-r=0.43r，这表明GO@lipid表面囊泡层的厚度是GO层厚度的0.43倍.

图2 GO聚集体的TEM图：（a） （b）GO的TEM图；（c） （f）lipid@GO 颗粒的TEM图；（c） （d）样品不同位置的TEM图；（e） （f） 放大的条纹图；（g） 显示了GO/lipid的结构示意图

图3 （a）～（d）lipid@GO复合颗粒形成了不同结构后的共聚焦显微镜图（包括绿色荧光通道，透射通道和混合通道）.其中（a） （c）是lipid@GO复合颗粒在激光照射之前的图；（b）（d）是相同的颗粒激光照射后的图，Scale bar 5 μm；（e） 显示了将GO@lipid复合颗粒当作标准的球形在表面形成囊泡后的结构示意图，R代表了整个复合结构的半径，r代表了GO聚集体的半径

3.3 控制囊泡在磷脂@GO表面形成的位置

从多次实验中（超过10次）发现囊泡的形成位置与颗粒上激光的照射位置密切相关，如图4所示，图4（a）是激光照射之前GO@lipid的形貌，图4（b）是激光照射之后的形貌，其中虚线框为激光照射区域，3 μm×3 μm.可以看到，激光照射1 min后，照射区域的边缘形成了磷脂突出物（图中白色箭头所指）.另外我们发现囊泡的形成与复合颗粒中GO的结构有关.囊泡更倾向于在很多GO碎片组成（边缘有棱角）的GO@磷脂复合体的边缘形成，而不会在由完整连续片层GO组成的表面光滑的GO@磷脂复合体表面形成.于是对于由很多GO碎片组成的GO@磷脂复合体而言，因为整个复合颗粒上都存在GO碎片有明显的边缘，导致整个GO@磷脂复合体表面都形成一圈稳定的囊泡，见图3（d）.

另外，囊泡的形成也依赖于GO聚集体的其他结构特征.例如：单片的GO表面修饰lipid后，其形成的复合体激光照射直到复合物表面的荧光淬灭时都没有明显的囊泡形成，见图5.

图4 lipid@GO表面囊泡形成的位置依赖于激光照射的位置（方框所示）

3.4 调控囊泡形成的动力学过程

除了囊泡产生的位置可调控外，我们还可通过激光照射的功率来调控囊泡产生的动力学过程.激光照射有两种模式，激光不断照射功率为5.5×10-2mW/μm2，激光间隔扫描模式功率为6.0×10-5mW/μm2.将激光模式由不断照射模式调节至间隔扫描模式时，GO@lipid表面会形成磷脂突出物，最后长成磷脂微管而不是形成囊泡，见图6（b）.这个动力学过程用视频的形式拍摄下来，其中第1帧和第112帧的图片被选取出来，如图6所示.在激光的间隔扫描模式照射下，仅仅只有少量的囊泡形成，大多形成微管，并且大量的微管在复合颗粒的表面稳定存在。当过了某个临界状态后，微管稳定存在。形成微管的面积φ达到40%，在复合颗粒表面形成的微管会稳定存在，并且延长激光照射时间会导致荧光的完全淬灭.

在连续激光照射模式下（在荧光完全淬灭前）我们将激光照射模式转化为间隔扫描模式时，在形成囊泡稳定存在的复合颗粒表面也会观察到微管的存在.这个动力学的过程是可以通过激光照射的强度来调控的.

4 结果讨论

共聚焦显微镜图片显示，激光照射后磷脂@石墨粉，磷脂@rGO复合颗粒表面会形成均匀的磷脂膜，但不会形成囊泡和微管，如图7（a）、图7（b）所示.为了解磷脂与GO的比例对于形成囊泡和微管的影响，我们将磷脂/GO的比例减半，激光照射复合颗粒，发现没有囊泡和微管形成，见图7（c）.该结果表明GO材料，充分的磷脂与GO比例是在GO@磷脂复合颗粒表面形成囊泡和微管的先决条件.另外，我们发现激光照射GO@磷脂复合颗粒后，在透射通道下可以清楚地看到GO聚集体表面颜色会变暗，这表明激光照射后GO表面的化学性质和结构都发生了变化.此外，用上海同步辐射测GO@磷脂，rGO@磷脂的小角X射线散射，发现GO（rGO）表面形成了多层磷脂膜.XRD测试的结果也表明激光照射GO@磷脂复合颗粒后GO会被还原成rGO.在我们的实验中，复合颗粒表面形成囊泡和微管主要是由于GO在激光照射下转变成rGO.

激光照射GO后会被还原，这个变化导致复合颗粒表面形成囊泡/微管.通过除去含氧基团，包括分解和重建，实现将GO还原为rGO的过程［19-20，29］.含氧基团分成气体：CO2，CO，O2和H2O［28］.气体的释放会扰动和破坏GO表面的磷脂膜，例如GO@磷激光照射后，复合颗粒会震动和移动以及磷脂膜表面会形成囊泡和微管.这是因为GO被激光照射表面的含氧基团分解产生气体对膜进行扰动从而使磷脂膜表面形成微管和囊泡.而石墨粉、rGO表面激光照射时不可能产生气体，因而没有这些现象.

图7 激光扫描共聚焦显微镜图：（a）磷脂@graphite；（b）磷脂@rGO；（c）磷脂@GO，磷脂/GO的比例减半后激光照射后的图

5 总结

本实验中，我们制备了一种新型微米级lipid@GO复合材料，lipid在GO表面形成了多层磷脂膜.通过激光照射lipid@GO复合材料表面，调节激光的模式来调控lipid@GO表面是形成囊泡或者微管.我们发现，激光照射lipid@GO复合材料后，在复合物的边缘先形成磷脂突出物，然后形成大量的囊泡，囊泡都吸附在复合物的表面，囊泡的尺寸是GO尺寸的0.43倍，形成囊泡的区域及囊泡形成的动力学过程都可以调控.降低激光的强度照射lipid@GO复合材料，其表面会形成微管而不是囊泡，复合材料表面形成囊泡和微管可能是由于激光照射GO还原成rGO的原因.通过本实验我们发现了一种新的方法来调节磷脂膜的形变.