嗜酸乳杆菌NX2-6细菌素 在猪肉保鲜上的应用

周 艳,曾维伟,朱筱玉,吕凤霞,别小妹,赵海珍,陆兆新

(南京农业大学食品科技学院,江苏南京 210095)

乳酸菌产抑菌物质总体来说是由酸性物质、细菌素、二氧化碳、过氧化氢、双乙酰、类细菌素等组成的复杂体系[1-4]。其中,细菌素近年来受到了广泛的关注,但其主要应用于果蔬及水产,在冷鲜肉中应用较少。Anacarso等[5]从火腿中分离的植物乳杆菌所产细菌素具有良好的抗腐败菌和致病菌活性。Shelegueda[6]获得的一株肠球菌产细菌素与壳聚糖、乳酸钠共同作用能够抑制鱼体中嗜冷菌群的生长。Zhou[7]指出，一株乳酸杆菌产细菌素能抑制草莓灰霉病孢子萌发。Shi等[8]研究发现，明串珠菌K7产细菌素能够有效抑制牛奶中单增李斯特菌的生长。

猪肉含水量高,富含蛋白质和多不饱和脂肪酸,易受到微生物污染、易腐败,从而导致肉类行业的经济损失[9]。如何保证猪肉的品质和安全性,是目前亟需解决的问题。肉类主要腐败菌包括假单胞菌、不动杆菌、莫拉氏菌、乳酸杆菌等[10],通常腐败微生物不会对人体健康造成不利影响,但当其数量达到一定程度时,会造成人体胃肠道紊乱[11]。然而,目前所采用的冷藏手段不能完全保证猪肉的安全性以及满足消费者的需求[9],所以将防腐剂与冷藏手段相结合是一个可行的方向[12]。

应用于猪肉的防腐剂根据其来源可分为化学防腐剂和生物源防腐剂两种,目前控制食品微生物的主要措施是添加化学防腐剂,但由于安全性问题,现代食品工业越来越注重生物源防腐剂的使用[13]。目前,微生物源保鲜剂在水产品中的应用已有报道[14],同样对于动物性食品,其在猪肉中的应用具有一定价值。

嗜酸乳杆菌NX2-6是由内蒙古锡林郭勒地区牧民家庭中以传统发酵方法制作的酸马奶中分离得到的,其产的细菌素acidocin NX2-6具有广谱抗菌活性。刘晓茜等[15]前期研究表明,嗜酸乳杆菌NX2-6产抑菌物质对樱桃番茄具有良好的保鲜效果。因此,嗜酸乳杆菌NX2-6所产抑菌物质具有作为生物防腐剂应用于冷鲜肉防腐的潜力。本实验以菌落总数、pH、挥发性盐基氮、感官评价为鲜度指标,探讨嗜酸乳杆菌NX2-6细菌素对冷鲜猪肉的保鲜效果。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

后腿精瘦肉 苏果超市雨润集团冷鲜肉专柜;Nisin 浙江银象生物科技有限公司;所有培养基用试剂 均为国药-沪试,分析纯。

HYG-A全温摇瓶柜 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司;SX-700高压蒸汽灭菌器 日本TOMY公司;UV-2450型紫外分光光度计 日本岛津公司;HH-2数显恒温水浴锅 国华电器有限公司;超净工作台 苏净集团安泰公司;HGPN型隔水式电热恒温培养箱 上海跃进医疗器械厂;ORION 3-star pH计 美国Thermo公司;Haier SC-350立式冷藏柜 青岛海尔特种冰柜有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 嗜酸乳杆菌NX2-6抑菌物质的效价研究

1.2.1.1 嗜酸乳杆菌NX2-6抑菌物质的制备 以脱脂乳培养基,由甘油管接种发酵12 h作为种子液,以8%的接种量接入实验室改良的发酵培养基(蛋白胨20.0 g/L,牛肉浸膏20.0 g/L,酵母浸膏10.0 g/L,K2HPO4·3H2O 3.0 g/L,柠檬酸三钠6.0 g/L,乙酸钠8.0 g/L,吐温-80 3.0 g/L,MgSO4·7H2O 0.40 g/L,MnSO4·H2O 0.076 g/L)中,发酵48 h后,5000 r/min离心30 min,弃沉淀,获得上清液(发酵上清为嗜酸乳杆菌NX-6细菌素粗品,考虑到使用成本,直接将粗品用于下步实验,下称“嗜酸乳杆菌NX2-6抑菌物质”)。

1.2.1.2 检测菌悬液的制备 将检测菌藤黄微球菌接至斜面,37 ℃培养24 h,再接入100 mL种子培养基(NA),33 ℃,180 r/min,培养8 h,至菌对数生长中后期,取出置于冰箱备用,作为检测种子液。

1.2.1.3 Nisin标准液的配制 准确称取8 g Nisin(103IU/mg),溶于100 mL 0.02 mol/L HCl中,配制成8000 IU/mL Nisin标准液备用,需要时用0.02 mol/L HCl稀释即可。

1.2.1.4 嗜酸乳杆菌NX2-6抑菌物质效价的测定 利用牛津杯单层琼脂法:在18 cm平板上放入牛津杯后倒入混有浓度为106～107CFU/mL的指示菌的培养基,待培养基凝固后取出牛津杯,在各孔中加入不同浓度的嗜酸乳杆菌NX2-6抑菌物质和不同浓度的Nisin,在37 ℃培养12 h,测定抑菌圈直径。根据Nisin的标准曲线以及嗜酸乳杆菌NX2-6抑菌物质的抑菌圈大小计算效价。

1.2.2 嗜酸乳杆菌NX2-6抑菌物质在猪肉保鲜上的应用

1.2.2.1 猪肉处理 获取猪肉肉段后,用冰盒运送至实验室,用无菌水冲洗肉段,于无菌钢丝网上沥干,在超净台中进行切分(每段约20 g),随机将猪肉分为如下5组(每组约100 g):

C组:对照组,浸泡蒸馏水30 min作为对照;N组:阳性对照组,浸泡0.5%(质量体积比,以0.02 mol/L的稀盐酸为溶剂,下同)Nisin溶液30 min;1%S组:低剂量处理组,以1%嗜酸乳杆菌NX2-6抑菌溶液浸泡30 min;2%S组:中剂量处理组,以2%嗜酸乳杆菌NX2-6抑菌溶液浸泡30 min;4%S组:高剂量处理组,以4%嗜酸乳杆菌NX2-6抑菌溶液浸泡30 min(预实验表明,2%S组与0.5%N组保鲜效果较为接近,故选择2%S为中剂量处理组,并设置1%S与4%S为低剂量处理和高剂量处理)。浸泡完成后,以无菌钢丝网沥干30 min后,分装于无菌的均质袋(北京路桥)中,在冰箱(4±1) ℃中存放9 d。样品在1、3、5、7和9 d分别进行微生物和理化测定。

1.2.2.2 菌落总数测定 根据GB4789.2-2016食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定[12],所有的计数均表示为lg CFU/g。

1.2.2.3 pH的测定 将10 g肉样品在100 mL蒸馏水中均质,并将混合物过滤,取滤液用电子pH计测定其pH。并设置重复。

1.2.2.4 挥发性盐基氮的测定 总挥发性盐基氮利用水蒸气蒸馏法进行测定。水蒸气蒸馏法是通过蒸馏加入MgO的均质肉样品进行。馏出液用含2%硼酸的水溶液进行收集,混合指示剂是用0.1 g甲基红溶解到100 mL乙醇的溶液。然后,硼酸溶液用0.02 mol/L的盐酸溶液滴定。TVB-N值(mg/100 g猪肉)取决于盐酸的消耗量，计算公式如下。

式中:X-试样中挥发性盐基氮的含量(mg/100 g);V-测定用样液消耗盐酸溶液体积(mL);V′-试剂空白消耗盐酸溶液体积(mL);c-盐酸标准溶液实际浓度(mol/L);m-试样质量(g)。

1.2.2.5 感官评定 猪肉样品的感官分析是由六个(三男三女)经过培训的评价者进行。颜色、气味、质地根据感官评价标准(表1)进行打分,其中1和10分别为最低和最高的质量分数，感官评分为6被认为是可接受的界限。

表1 低温贮藏条件下猪肉的感官指标评价标准(分)[16]Table 1 Scale for sensory evaluation of meat under the condition of low temperature storage(score)[16]

1.3 数据处理

利用SPSS 19.0中LSD(最小显著性差异法)对试验中各组指标的变化进行显著性分析,p<0.05为显著性水平。

2 结果与分析

2.1 嗜酸乳杆菌NX2-6抑菌物质的效价研究

嗜酸乳杆菌NX2-6抑菌物质的抑菌圈为(21.54±0.42) mm,根据标准曲线y=0.1918x+0.0267(R2=0.9979)得出嗜酸乳杆菌NX2-6抑菌物质的效价为14390.37 IU。

图1 Nisin效价标准曲线Fig.1 The standard curve of Nisin

2.2 嗜酸乳杆菌NX2-6抑菌物质在猪肉保鲜上的应用

2.2.1 不同处理对菌落总数的影响 冷鲜猪肉在储藏过程中,其表面的细菌繁殖会加速肉中蛋白质的分解腐败,因此菌落总数的变化可以反映猪肉的腐败程度[17]。试验表明,Nisin和不同浓度嗜酸乳杆菌NX2-6抑菌溶液处理均能抑制猪肉中微生物的生长。由图2可见,在1～9 d的储藏过程中,对照组菌落总数水平及微生物生长速度始终高于各处理组,4%S组效果最佳,而N组效果与2%S组无明显差异。到9 d时,所有处理组菌落总数水平均低于N组,由此可见,较Nisin而言,嗜酸乳杆菌NX2-6抑菌物质作用效果更持久。实验表明,嗜酸乳杆菌NX2-6抑菌物质能够明显抑制冷鲜猪肉中微生物的生长,4%组具有最佳作用效果,从3 d开始,就可将菌落总数水平控制在对照组的1/10以下。

图2 菌落总数随着储存时间的变化Fig.2 The changes of TAC in the process of storage

2.2.2 不同处理对pH的影响 猪肉在贮藏过程中,由于所含水解酶及微生物的作用,其pH会发生变化。由图3可知,猪肉的pH在贮藏过程中呈现下降后上升的趋势。这可能与冷鲜猪肉在贮藏前期糖原酵解产生乳酸导致pH下降有关。到贮藏中后期,猪肉源组织蛋白酶被释放出来,在加上微生物作用会导致猪肉的蛋白质分解而产生氨及胺类等碱性挥发性物质,从而使pH上升[18]。对照组pH比4%S组提前2 d开始上升,且上升速度较快。Nisin组、1%S组和2%组pH化拐点并没有延迟,但其上升速度受到了一定的抑制。由此可见,2%S组和4%S组处理能够很好地延缓猪肉pH的变化。由此可见,嗜酸乳杆菌NX-6抑菌物质能通过抑制猪肉中微生物的生长,减少由微生物导致的蛋白质分解,从而延缓pH的变化。

图3 pH随着储存时间的变化Fig.3 The changes of pH in the process of storage

2.2.3 不同处理对挥发性盐基氮的影响 挥发性盐基氮是动物性食品在贮藏过程中,因肌肉中内源酶和细菌共同作用,使得蛋白质分解而产生的氨及胺类等碱性含氮物质,通常可以作为肉类初期腐败的一个评定标准[19-20]。由图4可知,贮藏期间,猪肉中挥发性盐基氮含量呈逐步上升趋势,其中,对照组在7 d后就已高达28.56 mg/100 g。

图4 挥发性盐基氮随着储存时间的变化Fig.4 The changes of TVB-N in the process of storage

根据国家标准GB T5009.44-2003肉与肉制品卫生标准[21]的分析方法,猪肉食用标准为TVB-N≤20 mg/100 g,表明对照组猪肉在7 d时就已低于食用标准。而经嗜酸乳杆菌NX2-6抑菌溶液处理的猪肉中挥发性盐基氮含量上升趋势明显减缓,在9 d时,4% S组达到国标最高检出限。由此可见,嗜酸乳杆菌NX2-6抑菌溶液能通过抑制猪肉中微生物的生长,有效减少由细菌作用产生的挥发性盐基氮,4% S组处理效果最佳,可将猪肉的腐败延迟2 d。

2.2.4 不同处理对感官品质的影响 感官评分可以直观地反映猪肉在储存的品质变化。实验初始,猪肉气味正常,具有猪肉特有新鲜气味、红色与白色肌肉色泽,粘液透明,肌肉致密,弹性恢复良好。随着贮藏过程的进行,其颜色、质地、气味三项感官指标的变化均呈明显下降趋势。从表2可见,在贮藏过程中,除2%S组在第5 d时显著降低外(p>0.05),各处理组颜色评分与对照组没有显著性差异(p>0.05)。在色泽方面,N组在7～9 d显著优于其他各组(p<0.05)。第3、7、9 d时,1%S组、2%S组和4%S组气味评分显著高于对照组(p<0.05),其中4%S组最优。由此可见,嗜酸乳杆菌NX-6抑菌溶液处理有利于减缓猪肉的气味劣变,但不利于其颜色和质地的保持。

表2 感官指标变化Table 2 The change of sensory evaluation in the process of storage

3 结论

实验结果表明,冷鲜猪肉经4%嗜酸乳杆菌NX-6抑菌溶液浸泡处理30 min后,于4 ℃条件下贮藏9 d,可将猪肉腐败延缓2 d。从3 d开始,4%S组的菌落总数水平就始终在对照组的1/10以下;pH变化拐点比对照组延迟2 d出现,且变化趋势明显缓于对照组;TVB-N值比对照组推迟2 d到达国标最高检出限;从3 d开始，中高剂量处理组气味评分始终显著优于对照组(p<0.05)。由于嗜酸乳杆菌NX-6抑菌溶液浓度过高不利于猪肉颜色和质地的保持,故不宜选择更高浓度进行处理。

与常见生物源保鲜剂Nisin相比,嗜酸乳杆菌NX-6细菌素存在一定优势,但也有些许不足。经4%嗜酸乳杆菌NX-6抑菌溶液处理后的样品,颜色与质地评分低于Nisin组,其他各项指标均优于Nisin处理组。此外,Nisin在贮藏后期抑菌效果明显下降,而嗜酸乳杆菌NX-6细菌素则抑菌效果较Nisin更为稳定和持久,在7 d仍能将菌落总数控制在7 lg CFU/g以内。

综上所述,嗜酸乳杆菌NX-6细菌素在冷鲜猪肉保鲜中具有较大的潜力。在后续研究中,基于对猪肉感官品质的综合考虑,可以选择Nisin与本产品进行复配,在保证微生物生长得到抑制的同时,减缓猪肉色泽的劣变,从而取得更好的保鲜效果。