响应面法优化老山芹护绿工艺

王 炬,张秀玲,高 宁,于海鑫

(东北农业大学食品学院,黑龙江哈尔滨 150030)

老山芹(HeracleumoellendorffiiHance),又名东北牛防风、山芹菜,主要分布在我国东北黑龙江省大兴安岭地区,是东北地区一种著名的山野菜。老山芹富含膳食纤维、氨基酸、维生素和矿物质,特别是含有丰富的香豆素类和黄酮类化合物,能有效地预防和治疗便秘、高血压、高血脂和心血管类疾病,并对于心脏类疾病的术后康复、癌症的治愈过程具有辅助效果[1-3]。老山芹的嫩叶和茎杆均可食用,常用其做馅料、炒菜、凉拌等。

新鲜老山芹采摘时间具有季节性,又极易老化、黄化,令老山芹不便加工与贮藏,进而影响了老山芹本身的经济价值。由于对于老山芹这一山野菜的认知度较小,开发利用率低,因此,现针对于老山芹加工技术的相关报道较少,但随着山野菜的普及与推广,针对于老山芹加工护绿技术的研究变得尤为重要。有研究表明,植物黄化、老化是叶绿素的降解导致的,而叶绿素降解主要由以下两种途径,一是由于光照、氧气、pH、金属离子导致的叶绿素内卟啉环的中心Mg+被H+取代,形成脱镁叶绿素,导致叶绿素结构改变[4];二是酶促反应、脂质氧化导致的叶绿素降解,酶促降解途径主要是由叶绿体中过氧化物酶-H2O2酶促降解系统和胞质中的抗坏血酸-谷胱甘肽循环系统组成,这两种降解系统与活性氧含量相关[5-7]。刘茜茜等[14]主要研究了不同护色剂与其交互作用对于果蔬的护色效果,以叶绿素含量或色差值为单一指标,来判定护色剂的护色效果,而忽略过氧化物酶活性在叶绿素降解中的重要性与相关性,从而无法从降解途径解释护色剂浓度的增加或减少是如何令果蔬的叶绿素含量发生改变的。

本实验针对老山芹的生长特性和叶绿素特有的降解途径,以叶绿素含量与过氧化物酶活性为指标,旨在为老山芹选择最优的天然护绿剂配方。以老山芹为原料,在单因素实验的基础上,采用响应面法对老山芹护绿剂进行配方优化,选用叶绿素铜钠盐、抗坏血酸、茶多酚浓度为影响因素,以老山芹叶绿素含量和过氧化物酶(POD)活性为响应值进行响应面试验,对老山芹护绿工艺进行研究。以期延长老山芹的贮存期,增加老山芹的经济利用价值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

老山芹 黑龙江省加格达奇农林科学院;抗坏血酸、茶多酚、叶绿素铜钠盐(食品级) 哈尔滨市德美实验仪器经销有限公司;食品耐高温杀菌蒸煮袋 沧州华良包装有限公司。

Tu-1810紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司;YP20002电子天平 上海越平科学仪器有限公司;PHS-3C型pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司;G70D20CN1P-D2(S0)型微波炉 格兰仕微波生活电器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 微波辅助护绿剂护绿工艺流程

1.2.1.2 配制护绿剂 按照不同配方配制老山芹护绿溶液,利用柠檬酸调节溶液pH至6.50。

1.2.1.3 微波辅助护绿 将50 g老山芹原料浸泡在1.2.1.2所配置的200 mL护绿溶液中,置于功率为600 W的微波炉中处置2 min,静置10 min。

1.2.1.4 冷却 将静置后的老山芹溶液迅速放入0 ℃的冰水中迅速冷却至室温,并用清水反复冲洗老山芹叶片表面,防止护绿剂溶液残留,晾干。

1.2.1.5 真空包装 将护绿后的50 g老山芹放入真空包装袋中,注入20%氯化钠水溶液200 mL,真空包装。

1.2.1.6 高温灭菌 将包装完的老山芹放入高压灭菌锅内,根据孔瑾等[13]的研究结果及预实验的实验结果,设置灭菌温度为95 ℃,时间为15 min。

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 叶绿素铜钠盐浓度的确定 固定老山芹护绿剂溶液中抗坏血酸浓度为1.00 g/L,茶多酚浓度为1.50 g/L,选择叶绿素铜钠盐浓度梯度为:0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 g/L,将老山芹浸泡在pH=6.50的护绿溶液中(物料比为1∶4),利用微波(600 W,2 min)辅助护绿剂进行护绿处理,迅速冷却至室温,并用清水反复冲洗老山芹叶片表面,晾干,获得经护绿剂处理后的老山芹原料。研究老山芹护绿剂中叶绿素铜钠盐的浓度对老山芹原料中叶绿素和过氧化物酶活性的影响。

1.2.2.2 抗坏血酸浓度的确定 固定老山芹护绿剂溶液中叶绿素铜钠盐浓度为0.30 g/L,茶多酚浓度为1.50 g/L,选定护绿剂中抗坏血酸浓度分别为:0.50、0.75、1.00、1.25、1.75 g/L,其它步骤同1.2.2.1,研究老山芹护绿剂溶液中抗坏血酸浓度对老山芹原料中叶绿素和过氧化物酶活性的影响。

1.2.2.3 茶多酚浓度的确定 选定老山芹护绿剂溶液中茶多酚浓度分别为:1.00、1.25、1.50、1.75、2.00 g/L,叶绿素铜钠盐浓度为0.30 g/L,抗坏血酸浓度为1.00 g/L,其它步骤同1.2.2.1,研究老山芹护绿剂溶液中茶多酚浓度对老山芹原料叶绿素和过氧化物酶活性的影响。

1.2.3 响应面优化试验设计 在单因素实验基础上,选取叶绿素铜钠盐A浓度(g/L)、抗坏血酸B浓度(g/L)和茶多酚C浓度(g/L)作为试验因素,以叶绿素含量Y1(mg/g)和过氧化物酶活性Y2(U·g-1·min-1)为响应值,采用Box-Behnken的中心组合设计,进行 3因素3水平的响应面实验,具体见表1。

表1 响应面试验因素及水平表Table 1 Factors and levelsTable of response surface experiment

1.2.4 老山芹叶绿素含量及过氧化物酶活性测定方法

1.2.4.1 叶绿素含量的测定 在研钵中称取 1.00 g老山芹样品,加入适量石英砂、碳酸钙,并加入5 mL 95%乙醇溶液充分研磨,直至组织发白,肉眼无可见的老山芹叶片。将研磨后的液体静置7～8 min,过滤至50 mL 棕色容量瓶中,用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次,同样过滤至棕色容量瓶中,定容至50 mL。利用紫外分光光度计分别在663、645 nm波长下测量其吸光值,根据下列公式计算叶绿素含量,实验重复三次[14-15]。

叶绿素含量(mg/g)=[(20.29×A645+8.05×A663)×V]/(100×M)

式中,V:提取液总体积(mL);M:老山芹鲜重(g)。

1.2.4.2 过氧化物酶活性的测定 酶液的提取:在研钵中称取1.00 g老山芹样品,加入5 mL 0.20 mol/L pH6.5磷酸缓冲液冰浴研磨匀浆。将匀浆全部转入离心管,并用少量磷酸缓冲液反复冲洗研钵,将液体一并转入离心管中。在4 ℃,12000×g的条件下冷冻离心20 min,提取上清液4 ℃保存备用。

过氧化物酶活性的测定:50 mL 0.2 mol/L pH=6.5的磷酸缓冲液+38 μL愈创木酚+19 μL 30%过氧化氢,混合均匀后得到酶反应液,冷却备用。在反应池中加入1.5 mL的酶反应液和0.5 mL酶液后,立即用紫外分光光度计,在470 nm处每隔1 min测量一次吸光度,共测量3次。以每分钟内ΔA470变化0.001定义为1个酶活性单位[16-17]。

过氧化物酶活性(U·g-1·min-1)

式中,ΔA470:3 min内吸光度的变化;W:老山芹重量(g);t:反应时间(min);VT:提取酶液总体积(mL);VS:测定时吸取酶液体积(mL)。

1.3 数据处理与统计分析

采用Excel 2007对实验数据进行处理、整理后,运用SPSS 20.0统计分析软件对数据进行单因素方差分析、多重比较和相关性分析,并运用Origin 8.5软件作图。同时采用Design-expert 8.0.6软件中Box-behnken的中心组合设计进行响应面优化分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 叶绿素铜钠盐浓度对老山芹叶绿素含量及过氧化物酶(POD)活性的影响 当未添加护绿剂时,老山芹叶绿素含量为7.48 mg/g,POD活性为1340 U·g-1·min-1。添加一定浓度叶绿素铜钠盐后,结果如图1所示。随着叶绿素铜钠盐浓度的升高,老山芹叶绿素含量呈现先上升后下降的趋势,老山芹POD活性呈现先下降后上升的趋势。当护绿剂中叶绿素铜钠盐浓度为0.30 g/L时,老山芹中叶绿素含量达到最大值11.35 mg/g,POD活性达到最低值515 U·g-1·min-1。当叶绿素铜钠盐浓度由0.30 g/L逐渐升高,此时增加浓度叶绿素含量显著降低(p<0.05),POD活性显著升高(p<0.05)。特别当浓度升高至0.50 g/L时,叶绿素含量降低至8.46 mg/g,POD活性升高至691 U·g-1·min-1,这是因为,当护绿剂中的铜离子浓度过高时,老山芹体内的内源活性氧的清除功能降低,致使超氧自由基和H2O2基团大量累积,进而导致POD活性增强[6],同时POD的活性增强促进了POD-H2O2降解系统的进行,进而促进叶绿素降解[7]。因此,叶绿素铜钠盐浓度选取0.30 g/L较为合适。

2.1.2 抗坏血酸浓度对老山芹叶绿素含量及过氧化物酶(POD)活性的影响 由图2可知,抗坏血酸浓度对于老山芹叶绿素含量和POD活性有明显的影响。当老山芹护绿剂中抗坏血酸浓度为0.50～1.00 g/L时,老山芹叶绿素含量随着抗坏血酸浓度的增加而升高,POD活性随着抗坏血酸浓度的增加而降低,这是因为,抗坏血酸浓度的增加可以促进老山芹叶绿体和细胞质中的抗坏血酸-谷胱甘肽循环的进行[5],而此系统主要是利用抗坏血酸过氧化物酶,来清除植物体中的H2O2,因此老山芹POD活性降低,叶绿素含量逐渐升高。当抗坏血酸浓度为1.00 g/L时,老山芹叶绿素含量显著高于其他浓度(p<0.05),并达到最高值15.94 mg/g,POD活性显著低于其他浓度(p<0.05),并达到最低值854 U·g-1·min-1。随着浓度继续升高,老山芹叶绿素含量逐渐降低,POD活性逐渐升高。这是因为,当抗坏血酸浓度过高时,老山芹植物体内的pH发生改变,促进叶绿素的卟啉环中的Mg+被H+取代形成脱镁叶绿素,从而导致老山芹植物体内金属含量过多,促进氧化反应[13,26]。因此,抗坏血酸浓度选取为1.00 g/L较为合适。

图2 抗坏血酸浓度对老山芹叶绿素含量与POD活性影响Fig.2 Effect of ascorbic acid concentration on chlorophyll content and peroxidase activity of Heracleu moellendorffii Hance

2.1.3 茶多酚浓度对老山芹叶绿素含量与过氧化物酶(POD)活性影响 由图3所示,随着茶多酚浓度的升高,老山芹叶绿素含量呈现先上升后下降的趋势,老山芹POD呈现先下降后上升的趋势。当茶多酚浓度为1.00～1.50 g/L时,老山芹叶绿素含量随着茶多酚浓度的增加显著升高(p<0.05),老山芹POD活性随着茶多酚浓度的增加显著减少(p<0.05)。这是因为,茶多酚可以清除自由基,从而使POD活性降低,防止类囊体细胞膜脂质氧化所导致的叶绿素释放及降解[6]。当茶多酚浓度为1.50 g/L时,老山芹叶绿素含量达到最高值11.59 mg/g,老山芹POD活性达到最低值854 U·g-1·min-1。浓度超过1.50 g/L时,叶绿素含量逐渐降低,POD活性逐渐升高。这是因为,茶多酚的大量累积,使老山芹本身自由基的清除功能降低,

图3 茶多酚浓度对老山芹叶绿素含量与POD活性影响Fig.3 Effect of tea polyphenols concentration on chlorophyll content and peroxidase activity of Heracleu moellendorffii Hance

致使自由基基团大量累积,进而导致POD活性增强,类囊体细胞膜脂质氧化加剧,从而促进叶绿体降解[27]。因此,茶多酚浓度选取1.50 g/L较为合适。

2.2 响应面优化试验结果

在单因素实验结果的基础上,选取老山芹护绿剂中叶绿素铜钠盐浓度、抗坏血酸浓度、茶多酚浓度为试验因素,老山芹叶绿素含量与过氧化物酶活性为响应值,利用Design-Expert软件中的Box-Behnken实验设计方案,对老山芹护绿配方进行优化,实验结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Design and results of response surface experiment

2.2.1 老山芹叶绿素含量的回归模型及方差分析 利用Design-Expert 8.0.6软件,对表2中Y1叶绿素含量(mg/g)相关数据进行回归方程及方差分析,得到的分析结果见表3。

表3 Y1回归方程系数及显著性检验Table 3 Regression equation coefficients and significant test of Y1

根据表3实验结果,得到回归模型(1)为:

Y1=16.81+0.94A-0.49B+1.37C+1.91AB-0.83AC-0.95BC-1.86A2-1.51B2-1.72C2

式(1)

通过表3可知,模型(1)中,A、B、C的一次项中A、B、C均对叶绿素含量的影响极显著(p<0.01),在交互项中AB、AC、BC均对叶绿素含量的影响极显著(p<0.01),二次项A2、B2、C2均表现为极显著(p<0.01)。通过对比F值可知,对于叶绿素含量影响大小的顺序为C>A>B,即茶多酚浓度>叶绿素铜钠盐浓度>抗坏血酸浓度。

2.2.2 老山芹叶绿素含量的响应面分析 为了更加直观形象的描述三个因素对于Y1响应值的影响,利用Design-Expert 8.0.6软件在固定一个因素不变的环境下,对另外两个因素的交互作用做响应面和等高线图,分析其对于老山芹叶绿素的影响,其响应面和等高线图见图4～图6。

图4 叶绿素铜钠盐浓度和抗坏血酸浓度对老山芹叶绿素含量交互作用的响应面图和等高线Fig.4 Response surface and contour map of the interaction between chlorophyll sodium concentration and ascorbic acid concentration on the content of chlorophyll in Heracleu moellendorffii Hance

图5 叶绿素铜钠盐浓度和茶多酚度对老山芹叶绿素含量交互影作用的响应面图和等高线图Fig.5 Response surface and contour map of the interaction between chlorophyll sodium concentration and tea polyphenols concentration on the content of chlorophyll in Heracleu moellendorffii Hance

图6 抗坏血酸浓度和茶多酚度对老山芹叶绿素含量交互作用的响应面图和等高线图Fig.6 Response surface and contour map of the interaction between ascorbic acid concentration and tea polyphenols concentration on the content of chlorophyll in Heracleu moellendorffii Hance

由图4可知,当老山芹护绿剂中茶多酚浓度为1.50 g/L时,从响应面图曲线陡峭程度可以看出,A和B的交互作用对老山芹叶绿素含量有显著的影响。由图5可知,当老山芹护绿剂中抗坏血酸浓度为1.00 g/L固定不变时,

A浓度小于0.30 g/L,C浓度小于1.45 g/L时,等高线较密集,表明在此范围内A和C浓度的交互作用对老山芹叶绿素含量的影响显著。由图6可知,当老山芹护绿剂中叶绿素铜钠盐为0.30 g/L固定不变时,B浓度小于1.15 g/L,C浓度小于1.45 g/L时,等高线较密集,表明在此范围内B和C浓度的交互作用对老山芹叶绿素含量的影响显著。以上结果与方差分析的结果一致。

2.2.3 老山芹过氧化物酶活性(POD)回归模型及方差分析 利用Design-Expert 8.0.6软件对表2中Y2POD(U·g-1·min-1)相关数据进行回归方程及方差分析,得到的分析结果见表4。

表4 Y2回归方程系数及显著性检验Table 4 Regression equation coefficients and significant test of Y2

根据表4实验结果,得到回归模型(2)为:

Y2=464.45-126.46A-138.09B-110.15C+82.63AB+59.72AC+240.68BC+94.07A2+110.00B2+147.53C2

式(2)

通过表4可知,模型(2)中,A叶绿素铜钠盐浓度、B抗坏血酸浓度、C茶多酚浓度的一次项中A、B、C对老山芹POD活性的影响均显示为差异性极显著(p<0.01),交互项AB、BC、AC对老山芹POD活性的影响均表现为差异性极显著(p<0.01),二次项A2、B2、C2对老山芹POD活性的影响均表现为差异性极显著(p<0.01)。通过对比F值可知,对于老山芹POD活性影响大小的顺序为B>A>C,即抗坏血酸浓度>叶绿素铜钠盐浓度>茶多酚浓度。

2.2.4 老山芹POD活性的响应面分析 为了更加直观地描述三个因素对于Y2响应值的影响,利用Design-Expert软件在固定一个因素不变的环境下,对另外两个因素的交互作用做响应面和等高线图,分析其对于老山芹POD活性的影响,其响应面和等高线图见图7～图9。

图7 叶绿素铜钠盐浓度和抗坏血酸浓度对老山芹POD活性交互作用的响应面图和等高线图Fig.7 Response surface and contour map of the interaction between chlorophyll sodium concentration and ascorbic acid concentration on the activity of peroxidase in Heracleummoellendorffii Hance

图8 叶绿素铜钠盐浓度和茶多酚度对老山芹POD活性交互作用的响应面图和等高线图Fig.8 Response surface and contour map of the interaction between chlorophyll sodium concentration and tea polyphenols concentration on the content of chlorophyll activity of peroxidase in Heracleummoellendorffii Hance

图9 抗坏血酸浓度和茶多酚度对老山芹POD活性交互作用的响应面图和等高线图Fig.9 Response surface and contour map of the interaction between ascorbic acid concentration and tea polyphenols concentration on the activity of peroxidase in Heracleummoellendorffii Hance

由图7可知,当老山芹护绿剂中茶多酚浓度固定为1.50 g/L,从响应面图曲线陡峭程度可以看出,A和B的交互作用对老山芹叶绿素含量有显著影响,A浓度小于0.30 g/L,B浓度小于1.05 g/L 时,等高线较密集,表明在此范围内A和B浓度的交互作用对老山芹POD活性有显著的影响[16-17]。由图8可知,当老山芹护绿剂中抗坏血酸浓度为1.00 g/L固定不变时,A浓度小于0.30 g/L,C浓度小于1.55 g/L时,等高线较密集,表明在此范围内A和C浓度的交互作用对老山芹POD活性有显著影响。由图9可知,当老山芹护绿剂中叶绿素铜钠盐为0.30 g/L固定不变时,B浓度小于1.10 g/L,C浓度小于1.55 g/L 时,等高线较密集,表明在此范围内B和C浓度的交互作用对老山芹POD活性有显著影响。以上分析结果与方差分析的结果一致。

2.2.5 验证实验 通过响应面试验所获得的老山芹叶绿素含量和POD活性的二次回归数学模型进行分析,其结果显示,老山芹护绿剂最佳工艺为:0.32 g/L叶绿素铜钠盐、0.95 g/L抗坏血酸、1.68 g/L茶多酚。在此工艺下,老山芹叶绿素含量预测值为17.02 mg/g,POD活性为443.32 U·g-1·min-1。为了验证响应面结果的准确性,采用上述护绿工艺对老山芹进行护绿实验,并测量其叶绿素含量和POD活性,实验重复三次,结果表明老山芹叶绿素含量为16.98 mg/g,POD活性为453.54 U·g-1·min-1,与理论值相差不大,实验结果与模型切合度较好。灭菌后的老山芹产品在贮存三周后老山芹叶绿素含量仅下降2.60%,POD活性上升了3.10%。因此,此响应面所获得的老山芹护绿优化加工工艺准确可靠。

3 结论

在单因素实验的基础上,以老山芹叶绿素含量和POD活性为响应值,对老山芹护绿工艺中的老山芹护绿剂配方进行了响应面试验,并建立了响应值和各个因素之间的数学模型,根据此模型确定了老山芹护绿剂最佳优化配方:0.32 g/L叶绿素铜钠盐、0.95 g/L抗坏血酸、1.68 g/L茶多酚,在此条件下,老山芹叶绿素含量为16.98 mg/g,POD活性为453.54 U·g-1·min-1,对老山芹有很好的护绿效果。灭菌后的老山芹产品在贮存三周后,老山芹叶绿素含量仅下降2.60%,POD活性上升了3.10%,对于老山芹的护绿具有一定的应用价值。