异淀粉酶产生菌的分离鉴定 及异淀粉酶基因的克隆表达

赵淑琴

(甘肃农业大学基础实验教学中心,甘肃兰州 730070)

异淀粉酶(E.C.3.2.1.33,Isoamylase)是一种内切型淀粉酶,仅专一性作用于支链淀粉分支点的α-1,6-糖苷键,使其形成直链淀粉,而对直链淀粉分子中的α-1,6-糖苷键不起作用,这种特性最早在淀粉结构的理论研究中应用[1]。到七十年代,异淀粉酶的应用越来越广泛,逐步从实验室研究向工业化应用发展,已扩展到淀粉糖浆,啤酒和酒精生产等多个淀粉深加工领域[2]。主要原因是在淀粉加工过程中,异淀粉酶和糖化酶的协同作用可以加速糖化过程,并提高糖化率,和β-淀粉酶配合使用能极大提高麦芽糖得率[3-4]。由于异淀粉酶可以将最小单位的支链分解,最大限度地利用淀粉原料,因此是一种需求量很大的支链淀粉酶[5-7]。目前除了较成功地应用于高葡萄糖浆,高麦芽糖浆,低聚寡糖和啤酒生产,在医药领域亦有应用。

自然界中,异淀粉酶来源广泛。目前已在大米、甜玉米、马铃薯、蚕豆等许多植物中发现有异淀粉酶[8]。高等动物的肝脏、肌肉中也有类似于异淀粉酶水解α-1,6-糖苷键的酶存在,但将这些来源的异淀粉酶应用于高速发展的工业上是远远不够的。微生物来源的异淀粉酶数量庞大,而且根据菌的生长特性可以分离出耐高温、耐低温、嗜酸性、嗜碱性等适合于不同工业需求的异淀粉酶,因此近年来,人们越来越多的关注微生物来源的异淀粉酶。

1940年,日本学者首次从酵母细胞提取液中发现异淀粉酶[9],但能满足工业化生产的菌种还是比较难得[10]。1993年,王武等[11]对短杆菌异淀粉酶产生菌进行诱变,选育,从初始酶活为7 U/mL的出发菌,获得了摇瓶发酵液中酶活单位最高可达20 U/mL的突变菌株,是至今国内较为优良的产异淀粉酶菌种,但一直未见其后续研究及工业化生产的相关报道。2003年,王弋等[12]诱变中温地衣芽孢杆菌,其出发菌株的异淀粉酶活性达到3.35 U/mL,诱变后酶活提高到7.37 U/mL。2005年,夏静等[13]从云南梁河温泉水样中分离筛选到1株产异淀粉酶的栖热菌(Thermus),其产酶的初始酶活达4.14 U/mL。关于如何获得高产量、高稳定性微生物来源的异淀粉酶方面的报道在国内并不多见[7]。2016年,冉红艳[14]将嗜热放线菌的异淀粉酶基因克隆到大肠杆菌里,获得成功表达,酶活力是18.8 U/mL。国外,1988年,Amemura[15]首先使用鸟枪克隆法克隆并测序了P.amyloderamosa的异淀粉酶编码基因。1989年,Togoni等[16]完成了来源于一株假单胞菌的异淀粉酶编码基因的克隆和测序。1999年,Abe J[17]将FlavobacteriumodoratumKU异淀粉酶基因成功表达在大肠杆菌中,酶活力达到85.9 U/mL。2007年,Cho等[18]克隆并鉴定了来自Pectobacteriumcarotovrum亚种carotovorum(Pcc)LY34的异淀粉酶基因,并将其表达在大肠杆菌DH5α中,酶活力为35.5 U/mL。因此,细菌异淀粉酶普遍分泌量较低,常规方法如优化发酵产酶条件、紫外诱变等无法从根本上提高酶活,细菌异淀粉酶基因重组表达是解决这一难题的主要策略之一[19]。本实验从富含淀粉的土壤中分离筛选目的菌株,通过克隆其异淀粉酶基因,以大肠杆菌为受体细胞,旨在建立细菌异淀粉酶基因的克隆与表达系统,获得高产量、高稳定性的异淀粉酶,弥补工业上的需求。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

土壤样品 学校周边、奶牛场及校内食堂垃圾附近富含淀粉的土壤;支链淀粉 玉米来源,金品化学技术有限公司;TIANamp Bacteria DNA Kit 天根生化科技有限公司;Plus DNA Clean/Extraction Kit 北京艾比根生物技术有限公司;DNA凝胶回收试剂盒 上海生工生物工程技术服务有限公司;Primer star MAX、质粒提取试剂盒、DNA A-Tailing Kit、I型核酸染料Gold View、BamH I和Hind III限制性核酸内切酶 均购于索莱宝生物公司;其他试剂 均为国产分析纯。

TG1850-WS高速台式低温离心机 卢湘仪离心机仪器有限公司;JY-E型电泳仪 北京君意东方电泳设备有限公司;LDZX-50FBS立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂;SW-CJ-系列超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司;ZHWY-100B多振幅轨道摇床 郑州宏朗仪器设备有限公司;BWS-系列恒温水槽 上海一恒科学仪器有限公司;WFH-203紫外检测仪 上海青浦沪西仪器厂;ZF-1台式三用紫外检测仪 上虞市华宏净化设备厂。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基 平板分离培养基[20]:支链淀粉5.00 g,NaCl 2.52 g,琼脂粉7.5 g,蛋白胨5.00 g,蒸馏水500 mL,pH自然,121.0 ℃灭菌20 min。

液体发酵培养基:支链淀粉5.00 g,KH2PO40.61 g,CaCl20.04 g,(NH4)2SO40.50 g,蛋白胨1.00 g,蒸馏水200 mL,pH自然,121 ℃灭菌20 min。

1.2.2 样品的采集 在兰州周边奶牛场、校内食堂垃圾附近、下水道、糕点店、面粉厂等地将富含淀粉的土壤刮取20 g,装入自封袋,并标记时间和地点。

1.2.3 菌株的筛选 平板初筛[21]:称取10 g样品,放入锥形瓶中,倒入100 mL无菌水[13],放入恒温摇床中37 ℃,120 r/min,培养24 h后,用移液枪吸取1 mL并稀释100倍,从稀释液中吸取50 μL均匀涂布于平板分离培养基上,置于恒温培养箱内,37 ℃培养24 h后,挑选有透明圈、圈径比较大的菌落并标记备用[14-15]。

平板复筛:根据初筛平板上菌落的形状大小、颜色及是否产淀粉酶的特性,将初筛后的各种菌种分别接种在平板上,于恒温培养箱内37 ℃培养24 h。挑选透明圈较大的单菌落进行摇瓶复筛。

摇瓶复筛:从复筛平板上挑取单菌落,进行摇瓶复筛,将120 mL液体发酵培养基装入250 mL锥形瓶中,在恒温摇床内37 ℃、120 r/min培养72 h。发酵液于8000 r/min,离心10 min后,取上清液测定酶活。

1.2.4 酶活力的测定 淀粉酶酶活力的测定[21]:采用3,5-二硝基水杨酸法测定酶活力(以麦芽糖做标准曲线),测定实验菌株在OD520 nm的光密度值。酶活力单位定义:在40 ℃、pH6.0条件下,每分钟从1%的支链淀粉中释放出1 mmol麦芽糖的酶量定义为1个酶活力单位(U)

式中:K为标准曲线斜率;F为样品溶液反应前的总量,100 mL;S为样品测试量,S=0.5;T为时间,T=10 min;A为实验组吸光度;A0为对照组吸光度。

取15 mL具塞试管8支,编号,分别加入粗酶液和1%的支链淀粉溶液各0.5 mL,以蒸馏水代替粗酶液的试管做对照。再加入3,5-二硝基水杨酸1.5 mL,摇匀,沸水浴5 min,取出冷却,用蒸馏水稀释至10 mL,摇匀后用分光光度计于520 nm波长下比色,记录吸光值,根据标准曲线进行结果计算,每个样平行做3份,求平均值。

1.2.5 菌种的鉴定 形态学及生理生化鉴定:通过平板培养和穿刺接种法培养筛选出的菌株,观察其菌落形态和运动能力,再挑取平板培养的单个菌落,通过革兰氏染色将其分为革兰氏阳性菌G+和革兰氏阴性菌G-;通过孔雀绿芽孢染色后,观察该菌是否产生芽孢。

菌株主要生理生化研究:筛选出划线培养24 h后的菌种,然后挑取单菌落,进行细菌的硝酸盐还原试验、甲基红试验、接触酶试验(过氧化氢酶试验)、柠檬酸盐试验、硫化氢试验、明胶液化试验、吲哚试验、氧化酶试验、精氨酸水解试验[22]。

分子生物学鉴定:16S rDNA序列分析[23]:将提取的菌株总DNA,经琼脂糖凝胶电泳检测后,用16S rDNA通用引物进行PCR扩增。细菌专一性16S rDNA引物由TaKaRa公司合成,其序列为:正向引物(27f):5′-AGTTTGATCCTGGTCAG-3′,反向引物(1492r):5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′;16S rDNA PCR反应体系正向引物2 μL,反向引物2 μL,模板DNA4 μL,Primer star MAX 25 μL,ddH2O 17 μL。扩增过程为:94 ℃,5 min;94 ℃,30 s;55～65 ℃,30 s;72 ℃,2 min;共30个循环;72 ℃延伸10 min。扩增产物4 ℃保存。取扩增产物2 μL,用1%琼脂糖凝胶电泳检测。电泳条件为:电压110 V,电泳30～45 min。用上海生工的胶回收试剂盒进行16S rDNA PCR产物纯化。经纯化后,送与北京天一辉远公司完成测序。然后在NCBI中进行BIAST同源性比对,分析并构建系统发育进化树。

gyrB基因序列扩增鉴定:汤际亮等[23]报道,单独分析16S rDNA序列无法区分解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌这样亲缘关系很近的菌种。因此,采用gyrB序列分析法进一步鉴定。gyrB基因通用引物序列:上游引物:5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGC AYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′,下游引物:5′-AGCAGGATACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCR TCNGTCAT-3′;其中Y、N、R表示兼并碱基,Y表示C或T,N表示A、T、C或G,R表示A或G。

PCR反应条件:96 ℃变性1 min,58 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,共35个循环;72 ℃再延伸7 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后进行胶回收,并送与北京天一辉远公司进行测序,然后在NCBI中进行BLAST的序列同源性比对进一步分析鉴定。

1.2.6 异淀粉酶基因的克隆

1.2.6.1 引物设计 根据NCBI上的迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)异淀粉酶基因编码区序列(gb:KC133281.1),使用Oligo 6.57和Primer 5.0设计PCR扩增引物,送至金博研生物科技有限公司进行合成,两条引物的序列分别为:

LEFT:5′-GATGATGGCAGTTACGGCAG-3′;RIGHT:5′-CATGTCACTAGCTTGTCCGC-3′

1.2.6.2 异淀粉酶基因PCR扩增 菌株LZ-5基因组的提取,按照TIANamp Bacteria DNA Kit说明书提取,扩增反应体系如下:LEFT引物2 μL,RIGHT引物2 μL,模板DNA 4 μL,Primer star MAX 25 μL,ddH2O 17 μL。

扩增条件:热变性为94 ℃,30 s;退火温度为62 ℃,30 s;延伸温度为72 ℃,2 min;循环次数为30个;最后一个循环温度为72 ℃,10 min。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.2.6.3 扩增产物3′末端加A尾 按照Plus DNA Clean/Extraction Kit说明书进行扩增产物胶回收,回收产物利用DNA A-Tailing Kit对淀粉酶基因扩增产物进行3′末端加A尾。反应体系为10×A-Tailing Buffer 5 μL,dNTP Mixture 4 μL,A-Tailing Enzyme 1 μL,异淀粉酶基因扩增产物10 μL,ddH2O 30 μL。反应条件为72 ℃水浴槽中反应20 min,然后静置冰中2 min,最后4 ℃保存。

1.2.6.4 异淀粉酶基因与载体的A-T连接 将3′末端加了A尾的异淀粉酶基因的扩增片段与pMD-18T载体(3′添加了T尾)连接。反应体系为Solution I 6 μL,pMD-18T载体1 μL,异淀粉酶基因扩增产物5 μL,ddH2O 8 μL。将体系中溶液混合后,17 ℃连接16 h,获得重组质粒pMD-18T-iam1。

1.2.6.5 重组质粒转化大肠杆菌E.coliDH5a 取出储存在-80 ℃冰箱的大肠杆菌E.coliDH5a感受态细胞,放置冰中融化,再加入10 μL重组质粒,轻弹管壁使其混合均匀,置于冰中30 min,然后在42 ℃水浴槽中反应2 min,再置于冰中2 min。在离心管中加入1 mL LB液体培养基(不加氨苄青霉素),37 ℃摇床培养1 h后,5000 r/min离心1 min,弃去部分上清液,保留约100 μL上清液再次悬浮细胞,然后将其用涂布棒涂抹在含X-gal、IPTG和氨苄青霉素的LB平板上,放入培养箱中37 ℃培养12～16 h,形成具有蓝色和白色的单个菌落。挑选白色菌落即原核工程菌,置于LB液体培养基,37 ℃,180 r/min摇床培养12～16 h[24]。

1.2.6.6 重组质粒的提取及酶切鉴定 提取的重组质粒用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切。反应体系为10×Loading Buffer 3 mL,BamH Ⅰ 1 μL,Hind Ⅲ 1 μL,重组质粒pMD-18T-iam1 4 μL。然后往体系中加ddH2O至20 μL混匀后,放入37 ℃水浴槽中反应3 h。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,然后将检测符合异淀粉酶基因的片段送至金博研生物技术有限公司进行测序。

1.2.7 异淀粉酶基因在大肠杆菌中的表达 由于原核工程菌所产生的异淀粉酶是包涵体,所以将原核工程菌用1.0 mmol/L IPTG 诱导4 h后,用细胞破碎仪对工程菌进行破碎,以未插入重组质粒的大肠杆菌为对照,按照1.2.4酶活力的测定方法测工程菌的异淀粉酶活力[25]。

2 结果与分析

2.1 形态学观察及生理生化鉴定

采用碘熏法在平板上对异淀粉酶产生菌进行筛选，选出1株产异淀粉酶的菌株LZ-5，结果如图1所示,测定其酶活力值为10.9 U/mL。通过平板培养后观察菌株LZ-5为红色菌落,菌落不透明,有形状似小伞的皱褶,由中央凸起向周围扩散,边缘不整齐;芽孢可见,两端钝圆,直径约0.5 μm,长约2.0 μm。用孔雀绿芽孢染色后,能清晰看到芽孢,结果见图2。对菌株LZ-5进行生理生化鉴定,实验结果(表1)表明,菌株LZ-5可发酵多种糖,产酸产气,能液化明胶,吲哚试验和柠檬酸盐试验为阴性,其他试验均为阳性。结合形态学观察,初步推断该菌属于芽孢杆菌科。与文献报道[23]解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌的生理生化特性非常相近。

图1 菌株LZ-5的水解圈(A)及菌落形态(B)Fig.1 The transparent circle of strain LZ-5 after iodine staining(A)and the colonial morphology(B)

图2 菌株LZ-5革兰氏染色形态(A) 及孔雀绿芽孢染色形态(B)(10×100)Fig.2 Morphology of strain LZ-5 after gram staining(A) and after malachite green spore staining(B)(10×100)

表1 菌株 LZ-5的生理生化特性Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain LZ-5

2.2 分子生物学鉴定结果

2.2.1 菌株LZ-5的16S rDNA序列分析 菌株LZ-5经16S rDNA通用引物PCR扩增后,用琼脂糖凝胶电泳检测,结果如图3所示,将电泳后的条带进行胶回收后进行PCR扩增,再进行琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。将PCR扩增后的产物送与北京天一辉远公司进行测序,根据测得的序列在NCBI中进行BLAST比对,LZ-5菌株与枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)等的16S rDNA都具有高度相似性,相似度都为99%,序列比对(图4)分析它们都处于同一分支,所以通过16S rDNA不能确定该菌。

图3 LZ-5菌的16S rDNA序列PCR扩增结果 Fig.3 PCR amplification results of 16s rDNA sequence of strain LZ-5

图4 菌株LZ-5的16S rDNA序列比对Fig.4 The 16S rDNA sequence alignment of strain LZ-5

2.2.2 菌株的gyrB基因序列分析 菌株 LZ-5经gyrB基因序列扩增后进行琼脂糖凝胶电泳,将电泳后的产物进行胶回收,并送与北京天一辉远公司进行测序,测序的结果:

在NCBI中进行BLAST序列比对分析,结果发现其与枯草芽孢杆菌的gyrB基因具有99%的同源性，因此鉴定菌株LZ-5为枯草芽孢杆菌。

2.3 异淀粉酶基因的PCR扩增

以枯草芽孢杆菌基因组DNA为模板,LEFT和RIGHT为引物,退火温度为62 ℃,进行扩增。扩增产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测。由图5可知,扩增出的异淀粉酶基因片段大小约2000 bp。

图5 异淀粉酶基因的PCR扩增Fig.5 PCR amplification of isoamylase gene注： M:DNA Marker;1:异淀粉酶基因。

2.4 重组质粒的筛选

将重组质粒导入大肠杆菌E.coliDH5a感受态细胞,然后37 ℃摇床培养1 h,留约100 μL上清液重新悬浮细胞并涂抹在含X-gal、IPTG和氨苄青霉素的LB平板上,经37 ℃恒温培养12～16 h后,形成具有蓝色和白色的单个菌落。由图6可知,重组质粒成功导入了大肠杆菌。

图6 蓝白斑筛选Fig.6 White-blue plaque selection

2.5 重组质粒鉴定

挑选白色菌落,置于LB液体培养基(含氨苄青霉素),培养12～16 h,然后将提取的重组质粒进行酶切,酶切产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。由图7可知,酶切下来的基因片段大小为2000 bp,与图5中PCR扩增出的异淀粉酶基因大小接近。重组质粒的酶切小片段回收后,送至金唯智生物技术有限公司进行测序。测序结果表明:异淀粉酶基因全长1980 bp,通过软件MEGA5.1上的Clustal W与NCBI上报道的迟缓芽孢杆菌异淀粉酶基因进行比对,相似度为96%,表明已成功克隆出了异淀粉酶基因。

图7 质粒pMD-18T-iam1载体酶切鉴定的电泳结果Fig.7 Restriction fragment analysis of vector pMD-18T-iam1注：M:DNA Marker；1:环状质粒；2:线性质粒； 3:重组质粒酶切产物；4:异淀粉酶基因。

2.6 原核工程菌产异淀粉酶的酶活性

将原核工程菌用1.0 mmol/L IPTG诱导4 h后,用细胞破碎仪对工程菌进行破碎,以未插入重组质粒的大肠杆菌为对照,按照1.2.4的异淀粉酶酶活力测定方法,测得异淀粉酶酶活力为28.4 U/mL,是原菌的2.6倍。

3 结论

本实验从富含淀粉的土壤中筛选出1株高产异淀粉酶的菌株LZ-5,通过菌落形态观察、生理生化特性实验、16S rDNA序列及gyrB基因分析,构建系统发育进化树对其进行鉴定,结果表明菌株LZ-5为枯草芽胞杆菌,根据NCBI上的迟缓芽孢杆菌异淀粉酶基因设计引物,通过聚合酶链式反应(PCR)获得该菌株的异淀粉酶基因的序列,构建pMD-18T-iam1载体,导入到E.coliDH5a感受态细胞,经IPTG 诱导表达,构建的大肠杆菌工程菌,通过细胞破碎仪破碎后,测得异淀粉酶酶活力为28.4 U/mL,是菌株LZ-5的2.6倍。在本研究基础上,下一步探索把该异淀粉酶基因采用合适的载体导入出发菌株枯草芽孢杆菌中,实现同源表达,利用该菌株天然的、优良的分泌表达系统,实现突变异淀粉酶基因更高效的表达。