5—氨基酮戊酸光动力对大鼠痤疮模型免疫功能的影响

陈向齐 宋洪涛 陈胜平

[摘要]目的：探讨5-氨基酮戊酸光动力（5-aminolevulinicacid photodynamic therapy，5-ALA-PDT）对大鼠痤疮模型局部免疫功能的影响及相关机制。方法：将痤疮丙酸杆菌接种大鼠耳部，建立大鼠痤疮炎症模型，给予5-ALA-PDT治疗。对组织进行HE染色，采用免疫组化法检测大鼠巨噬细胞CD68、CD163、Toll样受体2（Toll-like receptor-2，TLR2）、髓样分化因子88（MyD88）的表达。结果：痤疮丙酸杆菌接种于大鼠耳部可建立大鼠痤疮炎症模型，HE染色见大量炎性细胞弥漫性浸润。CD68、CD163、TLR2、MyD88在大鼠耳部皮肤炎症细胞质内表达，空白组较少，接种P.acnes后表达增高，加激动剂Pam3CSK4后表达更高，5-ALA-PDT治疗后较P.acnes组低。结论：大鼠耳部毛囊皮脂腺及周围可少量表达TLR2，接种痤疮丙酸杆菌后，表达显著增加，导致巨噬细胞等免疫细胞向毛囊皮脂腺周围聚集。5-ALA-PDT治疗后TLR2表达减少，减弱机体对细菌的免疫反应，从而减轻炎症。

[关键词]5-氨基酮戊酸；光动力；痤疮丙酸杆菌；痤疮；CD68；CD163；TLR2；MyD88

[中图分类号]R758.73+3 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2018）06-0051-04

Abstract： Objective To study the influence of 5-ALA-PDT on the Toll-like receptor-mediated immune response in acne model in SD rats. Methods Acne inflammation model of rat ear induced by Propionibacterium acnes were established and then treated with 5-ALA-PDT. Section was made for HE staining. Immunohistochemical staining was used to observe the expression of CD68， CD163， TLR2， and MyD88. Results Acne inflammation model of rat ear was established by inoculating Propionibacterium acnes to rat ears. Diffuse infiltrations of inflammatory cell were observed by HE staining. Compared with the blank group， the expression of CD68， CD163， TLR2， MyD88 were decreased in rat ears inflammatory cells， but increased after stimulated with P.acnes and increased further after Pam3CSK4 adminstration. The expression level decreased and was lower than the model group after received 5-ALA-PDT. Conclusion TLR2 expression was low in rat ear pilosebaceous unit and its surrounding tissue and the expression increased significantly after inoculating Propionibacterium acnes， which induced macrophage infitration in pilosebaceous unit. 5-ALA-PDT decreased the expression of TLR2 and alleviates bodys immune response to bacteria， thus relieved inflammation

Key words： 5-aminolevulinic acid； photodynamic therapy； Propionibacterium acnes； acne vulgaris； CD68； CD163； TLR2； MyD88

痤瘡病变第一步为以毛囊皮脂腺单位的亚临床微粉刺，可能演变成封闭或开放粉刺和炎性病变，如丘疹、脓疱、结节和囊肿。粉刺形成被认为是涉及到毛囊的角化过度，继发于毛囊滤泡角质形成细胞过度角化以及它们脱屑减少。炎性细胞因子IL-1参与此过程，并诱导角化过度。微粉刺或粉刺后来可能发展成炎症病变，结果CD4+T细胞活化和迁移，角质形成细胞分泌细胞因子以及巨噬细胞和嗜中性粒细胞聚集到毛囊、皮脂腺，增强皮脂分泌[1]。其中，导致痤疮的发病因素主要是痤疮丙酸杆菌，是正常皮肤菌群的一部分，但它在痤疮患者的毛囊皮脂腺内明显增加[2]。痤疮丙酸杆菌通过诱导单核细胞分泌促炎症细胞因子包括TNF-α、IL-1和IL-8导致炎症发生，特别是IL-8以及其它痤疮丙酸杆菌诱导的趋化因子可召集嗜中性粒细胞到毛囊皮脂腺中发挥重要作用。此外，痤疮丙酸杆菌释放的脂肪酶、蛋白酶和透明质酸酶可导致组织损伤[3]。然而，这种细菌在痤疮的发病机制中的确切作用仍需进一步阐明。

1 材料和方法

1.1 菌液的制备：挑取单个痤疮丙酸杆菌（ATCC6919，广东微生物研究所）的菌落，并接种于厌氧脑心浸液肉汤培养基（青岛海博生物技术有限公司）中，在37℃厌氧环境下培养3d，用麦氏比浊法计数，以生理盐水调配细菌浓度至1×108cells/ml。

1.2 实验动物处理：从福建医科大学动物实验中心购置清洁级雌性SD大鼠[合格证号：SCXK（闽）2012-0001]48只，均为3周龄，体重约100～120g。经医院动物伦理委员会（批件号：2014038）审核认证。实验前大鼠耳部备皮。备皮清理完毕后，48只大鼠随机分成4组，空白组、P.acnes组、P.acnes+Pam3CSK4（激动剂，北京中科迈晨科技有限公司）组、P.acnes+ALA-PDT组，每组各12只。空白组双耳注射无菌生理盐水（50μl/200g）。厌氧环境下培养痤疮丙酸杆菌，并接种于其余3组SD大鼠双耳（50μl/200g），诱导炎症反应1周后，用无菌针头挑取耳廓肿胀部位，接种于厌氧脑心浸液肉汤培养基中，在37℃厌氧环境下培养3d，证明为痤疮丙酸杆菌感染[4]。对P.acnes+ALA-PDT组的大鼠进行5-ALA-PDT治疗，常规酒精消毒照射区皮肤，腹腔注射氯胺酮（100mg/kg）麻醉动物，P.acnes+ALA-PDT组大鼠双耳外敷5% ALA（上海复旦张江生物医药股份有限公司），避光封包1.5h，擦拭干净后用LED-IB光动力治疗仪（武汉亚格光电技术有限公司）照射。照光方案为每周1次，共3周。参数设定为：能量密度100mW/cm2，波长（633±10nm），照射时间设定为10min，能量60J/cm2。空白组、P.acnes组、P.acnes+Pam3CSK4 组大鼠均于注射后第3周处死，P.acnes+ALA-PDT组大鼠于5-ALA-PDT治疗完毕后立即处死。

1.3 免疫组化法检测各组CD68、CD163、TLR2、MyD88表达情况：常规石蜡切片，HE染色。石蜡切片脱蜡和水化，组织抗原用高压修复。每张切片加1滴3%过氧化氢溶液，在室温下孵育10min以阻断内源性过氧化物酶。每张切片加入1滴一抗（CD68、MyD88的浓度为1：100，CD163、TLR2的浓度为1：50）[CD68、CD163（大鼠）多克隆抗体，购自中杉金桥生物技术开发有限公司；TLR2多克隆抗体购自上海钰博生物科技有限公司；MyD88多克隆抗體购自上海安研商贸有限公司]，室温下孵育60min。每张切片加入1滴聚合物增强剂（试剂A），在室温下孵育20min。每张切片加入1滴酶标抗鼠聚合物（试剂B），在室温下孵育30min。每张切片加入2滴新鲜配制的DAB显色液，显微镜下观察，阳性显色为棕黄色。蒸馏水冲洗3次，苏木素复染，0.1%盐酸分化，自来水冲洗，最后用PBS冲洗1次，水性封片剂封片。

1.4 评价指标：TLR2、MyD88、CD68、CD163阳性表达位于上皮细胞和巨噬细胞细胞质内，TLR2在细胞膜也有表达，镜下所见均为棕黄色颗粒状。以CD68、CD163、TLR2和MyD88阳性染色强度及（或）阳性细胞数分为3级：阴性（-）：有10%以下大鼠耳部巨噬细胞着色；弱阳性（±）：11%～50%以下大鼠耳部巨噬细胞着色；阳性（+）：有50%以上大鼠耳部巨噬细胞着色[5]。

1.5 统计学分析：实验数据用SPSS 18.0统计软件进行统计分析，等级资料行多组非参数秩和检验（Kruskal-Wallis Test），P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠耳部皮肤外观大体表现：空白组大鼠耳部皮肤正常；P.acnes组大鼠耳部皮肤红肿明显；P.acnes+Pam3CSK4组大鼠耳部皮肤红肿显著；光动力治疗后大鼠耳部皮肤红肿消退，颜色接近正常。见图1。

2.2 大鼠耳部皮肤组织病理检测结果：HE染色结果显示，空白组大鼠表皮较薄，毛囊、皮脂腺结构正常；P.acnes组可见大量炎症细胞浸润；P.acnes+Pam3CSK4 组有大量炎症细胞浸润；P.acnes+ALA-PDT组毛囊真皮层可见少量炎性细胞。见图2。

2.3 免疫组织化学检测结果

2.3.1 大鼠耳部皮肤TLR2含量检测结果：TLR2免疫组化染

色结果显示主要在大鼠耳部上皮细胞和巨噬细胞胞膜和细胞质内弥漫性阳性表达，呈棕黄色，毛囊、皮脂腺也有阳性表达（见图3）。P.acnes+Pam3CSK4 组含量最高，各组具体情况见表1。

2.3.2 大鼠耳部皮肤MyD88含量检测结果：MyD88免疫组化染色结果显示主要在大鼠耳部上皮细胞、巨噬细胞胞质内弥漫性阳性表达，呈棕黄色，毛囊、皮脂腺也有阳性表达（见图4）。P.acnes+Pam3CSK4 组含量最高，各组具体情况见表2。

2.3.3 大鼠耳部皮肤CD68含量检测结果：CD68免疫组化染色结果显示主要在大鼠耳部上皮细胞、巨噬细胞胞质内弥漫性阳性表达，呈棕黄色，毛囊、皮脂腺也有阳性表达（见图5）。P.acnes+Pam3CSK4组含量最高，各组具体情况见表3。

2.3.4 大鼠耳部皮肤CD163含量检测结果：CD163免疫组化染色结果显示主要在大鼠耳部上皮细胞和巨噬细胞胞质内弥漫性阳性表达，呈棕黄色，毛囊、皮脂腺也有阳性表达（见图6）。P.acnes+Pam3CSK4 组含量最高，各组具体情况见表4。

3 讨论

3.1 TLR2：目前，10多种TLRs在人类中确定，这些受体的微生物配体已被证实，TLR4能介导宿主对革兰阴性菌脂多糖反应，TLR2介导宿主革兰氏阳性菌的肽聚糖反应，而TLR5介导宿主对细菌鞭毛蛋白反应[6]。当Toll样受体暴露于微生物的配体后被激活，TLR的胞内部分可能引发MyD88依赖性途径参与，比如IL-1受体相关激酶和肿瘤坏死因子受体活化因子6，最终导致转录因子NF-κB的核转位。NF-κB然后调节许多免疫反应基因[7]。

Kim J等[3]用TLR基因敲除小鼠检查由痤疮丙酸杆菌介导的激活的TLR6与TLR1的作用。腹膜巨噬细胞是从野生型、TLR2-/-、TLR6-/-和TLR1-/-TLR2-/-小鼠获得，用痤疮丙酸杆菌激活，并且上清液测定炎性细胞因子IL-6的存在。痤疮丙酸杆菌能诱导野生型小鼠、TLR1-/-小鼠和TLR6-/-小鼠的IL-6释放，但TLR2-/-小鼠没有。这些结果表明是TLR2介导痤疮丙酸杆菌诱导的细胞活化，而不是TLR4、TLR6或TLR1。本次结果显示P.acnes组TLR2的表达较空白组高，说明大鼠耳部接种痤疮丙酸杆菌后TLR2受体表达增高，与Kim J等[3]的结果一致。P.acnes+ALA-PDT组平均秩和较P.acnes组低，说明5-ALA-PDT治疗后大鼠耳部TLR2表达减少。

3.2 髓样分化因子（MyD88）：MyD88是Toll样受体信号通路的一个关键的衔接分子，在上游信息传递和疾病的发生发展中起着重要作用。MyD88结构上有3个功能区域：N-端死亡区，中间区域和C末端区的Toll区。Toll区类似于IL-1受体的胞质区，通过招募连接蛋白来转导信号[8]。实验结果表明激动剂可通过激动TLR2激活MyD88。P.acnes+ALA-PDT组较P.acnes组低，说明5-ALA-PDT治疗后大鼠耳部MyD88表达减少，然而下游信号仍有待进一步研究。

3.3 巨噬细胞CD68、CD163的表达：巨噬细胞可以清除衰老的宿主细胞和分子，在抵抗感染中也起着重要作用[9]，这是在炎症过程中的关键角色之一，主要是在以下几个方面：炎症周围高浓度趋化因子可诱导巨噬细胞活化，并使巨噬细胞向感染部位募集，激活的巨噬细胞进一步分泌IL-8等因子，引起更多的巨噬细胞活化募集，释放促炎细胞因子如IL-6和前列腺素等炎症介质，诱导并加重局部炎症反应[10]。CD68、CD163可以作为M2型巨噬细胞活化的重要的标志物[11]。本次P.acnes组CD68的表达较空白组高，说明大鼠耳部接种痤疮丙酸杆菌后CD68表达增高，和Kim J等[3]的结果一致。P.acnes+ALA-PDT组平均秩和较P.acnes组低，说明5-ALA-PDT治疗后大鼠耳部炎症减轻。且P.acnes组CD163的表达较空白组高，说明大鼠耳部接种痤疮丙酸杆菌后CD163表达增高，和Kim J等[3]的研究结果一致，且5-ALA-PDT治疗后表达降低。

3.4 TLR2激动剂Pam3CysSK4：Pam3CysSK4是一种合成的细菌脂肽，是TLR2的特异性激动剂。已有研究证实TLR2激动剂Pam3CysSK4可以增加CD8+T细胞数量并加速炎症进程[12]。采用TLR2的激动剂Pam3CysSK4来干预大鼠耳部，以了解TLR2信号通路在体内的作用。实验结果表明：TLR2激动剂Pam3CysSK4刺激TLR2表达增多，可能会进一步加剧大鼠耳部炎症细胞的浸润。这些结果进一步证明了这条通路在痤疮的发病中的作用。

综上所述，大鼠耳部毛囊皮脂腺及周围可少量表达TLR2，接种痤疮丙酸杆菌后，表达显著增加，导致巨噬细胞等免疫细胞向毛囊皮脂腺周围聚集。5-ALA-PDT治疗后TLR2表达减少，减弱机体对细菌的免疫反应，从而减轻炎症。TLR2可调节免疫反应，为寻常痤疮治疗提供了一种特异性靶点。这些发现可能会促进治疗寻常痤疮新药物的研发。

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[收稿日期]2017-12-20 [修回日期]2018-05-02

编辑/朱婉蓉