山楂叶总黄酮对非酒精性脂肪性肝病大鼠肝脏FXR/SREBP-1c表达的影响*

陆永娟 陈芝芸 何蓓晖# 严茂祥

1 浙江省嘉善县第一人民医院 浙江 嘉善 314100 2 浙江中医药大学附属第一医院 浙江 杭州 310006

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是无过量饮酒史、以肝实质细胞脂肪变性和脂肪贮积为特征的临床病理综合征，是临床常见的慢性肝病之一[1]。NAFLD的发病机制尚未完全阐明，肝脏脂质沉积是其发病的基础。近来研究发现，胆汁淤积、胰岛素抵抗、游离脂肪酸增多、氧化应激与脂质过氧化等代谢异常可以导致NAFLD的发生、发展，法尼酯衍生物受体（FXR）可以调节胆汁酸、糖、脂的代谢，可能参与NAFLD的发生发展。山楂叶总黄酮（TFHL）具有抗脂质过氧化、抑制或清除氧自由基、调节血脂、改善肝微循环及抗炎等作用。项目组前期研究发现，TFHL能明显改善高脂诱导的非酒精性脂肪性肝炎（NASH）大鼠肝脏脂质代谢紊乱，抗氧化应激，抑制炎性细胞因子的分泌等作用[2-3]。为进一步探讨TFHL的作用机制，本研究观察其对NAFLD模型大鼠肝组织FXR/固醇调节元件结合蛋白（SREBP-1c）通路的影响。

1 材料与方法

1.1 动物：雄性SD大鼠40只，体重170±10g，SPF级，上海斯莱克实验动物有限公司，实验动物许可证号：SCXK（沪）2012-0002。适应性喂养1周后进行实验。

1.2 主要药品与试剂：TFHL(Lot：#20111211)，总黄酮含量＞95%，由山西康立生药业有限公司提供；总RNA提取试剂盒（Cat：KD10111101-G）由爱思进生物技术（杭州）有限公司提供；cDNA合成试剂盒（Cat：BK1401）和荧光定量PCR试剂盒（Cat：BKA3206）由宝生物工程(大连)有限公司提供；引物由宝生物工程（大连）有限公司设计并合成，FXR上游引物：5’-AAGTGACCTCCCGACCA AGA-3’,下游引物：5’-TGGCATTCTCTGTTTGCTGT-3’,扩增片段107b；小异二聚体伴侣分子（SHP）上游引物：5’-TGCCTGGAGTCTTTCTGGAG-3’,下游引物：5’-ATGTTCTTGAGGGTGGAAGC-3’,扩 增 片 段227bp；SREBP-1c上游引物：5’-GCTTCTCTGGGCTCC TCTCT-3’，下游引物：5’-GCACTGGCTCCTCTTTGA TT-3’,扩增片段154bp；脂肪合成酶(FAS)上游引物：5’-AGTGGGAAGACCCTGACTCC-3’,下游引物：5’-ATAGACGCCCTGGAAATGAG-3’，扩增片段 152bp；β-actin上游引物：5’-TGTTGCCCTAGACTTCTT CGAGCA-3’,下游引物：5’-CCATACCCAGGAAGGAAG GCT-3’,扩增片段112bp。蛋白抽提试剂盒（Cat：P1250）由北京普利莱基因技术有限公司提供；PotentECLKit（Cat：P1425）由联科生物技术有限公司提供；FXR兔抗多克隆抗体H-130(sc-13063)和SREBP-1c兔抗多克隆抗体K-10(sc-367)由美国SantaCruz公司提供；FAS兔抗多克隆抗体c20G5(#3180S)由美国CellSignaling公司提供。

1.3 主要实验设备：AB17900PCR扩增仪（美国ABI公司），多功能酶标仪（美国Thermo公司），LEECARM2025病理切片机（德国Leica公司），日立7020全自动生化分析仪（日本高新技术株式会社），OSE-Y10G电动组织研磨器（天根生化科技有限公司），Mini-PROTEANTetra（美国BioRad公司），FCE型ProteinSimple化学发光成像系统（上海百赛生物技术有限公司）。

1.4 实验方法：大鼠随机分为正常组、模型组、TFHL高、中、低剂量组共5组，每组8只。正常组予标准饲料喂养，其他4组每天予高脂饲料（在82.5%标准饲料基础上添加10%猪油、2%胆固醇、0.5%胆酸钠和5%蛋黄粉）连续喂养12周，同时从造模第5周起TFHL高、中、低剂量组每日分别灌服160mg/kg、80mg/kg、40mg/kg的TFHL，正常组和模型组以等量的蒸馏水灌胃，均连续灌胃8周。实验第12周末，空腹麻醉下腹腔静脉采血，检测甘油三酯（TG）、胆固醇（CHOL）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、门冬氨酸氨基转移酶（AST）水平；并收集肝脏标本，肝右叶部分组织在10%中性甲醛中固定用于病理观察。部分以生理盐水制成10%肝组织匀浆，再以异丙醇提取、氧化铝吸附后，分别采用磷脂-乙酰丙酮显色法测定TG含量，高铁-硫酸显色法测定CHOL含量。部分肝组织提取总RNA后再合成cDNA，Realtime-PCR检测肝组织中FXR、SHP、SREBP-1c、FAS的mRNA表达，以β-actin为内参，相对表达量（2-△△Ct）来表示目的基因mRNA的表达水平。部分肝组织提取蛋白后用WesternBlot检测肝组织中FXR、SREBP-1c、FAS的蛋白表达。化学发光成像系统曝光得到蛋白条带图，用Quantityone软件分析灰度值，用目的蛋白/GAPDH代表目的蛋白的相对表达量代表目的蛋白的表达水平。

1.5 统计学处理：采用SPSS17.0软件，计量资料均以均数±标准差（±s)表示。多组样本间的比较釆用单因素方差分析(one-wayANOVA)，各组之间两两比较，若方差齐性时采用LSD检验，若方差不齐性时采用Dunnett’s T3检验。P＜0.05被认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 TFHL对NAFLD大鼠肝组织CHOL、TG水平的影响：

NAFLD模型组大鼠肝脏TG、CHOL水平较正常组显著增高（P＜0.05,P＜0.01）；TFHL各剂量组大鼠肝脏TG含量较模型组明显减少（P＜0.05），TFHL高、中剂量组大鼠肝脏CHOL含量较模型组明显减少（P＜0.01，P＜0.05）。

2.2 各组大鼠血清中ALT、AST、CHOL和TG水平比较：详见表1。

表1 山楂叶总黄酮对NAFLD大鼠血清ALT、AST、CHOL和TG水平的影响(±s，U/L)

表1 山楂叶总黄酮对NAFLD大鼠血清ALT、AST、CHOL和TG水平的影响(±s，U/L)

注：与正常组比较，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.01。

0.69±0.14 0.59±0.15 0.61±0.06 0.62±0.11 0.59±0.07正常组模型组TFHL低剂量组TFHL中剂量组TFHL高剂量组8 8 8 8 8 36.88±7.04 183.00±71.51*104.13±29.44△97.25±40.65△83.00±14.16△94.13±11.57 284.50±36.73*206.13±44.86△183.38±58.39△174.38±19.11△1.28±0.39 1.58±0.26*1.53±0.27 1.47±0.20 1.40±0.18

2.3 各组肝组织病理变化：光镜下观察，正常组肝小叶完整，肝细胞排列整齐，未见肝实质细胞病变，中央静脉和汇管区结构正常。模型组肝小叶轮廓不清，肝细胞肿大，胞浆疏松，富含脂肪粒，出现重度脂肪变、炎细胞浸润、小叶内散在坏死灶和部分肝细胞气球样变等NAFLD的病理改变；经TFHL治疗后肝细胞肿大减轻，肝细胞脂肪沉积减少，小叶内坏死灶和气球样变减轻。见图1、图2。

2.4 TFHL对 NAFLD大鼠肝组织 FXR、SREBP-1c、FAS、SHPmRNA表达的影响：NAFLD模型组大鼠肝组织FXR、SHPmRNA水平较正常组显著下降（P＜0.01）；TFHL高、中、低剂量组大鼠肝组织FXR、SHPmRNA水平较模型组明显增加（P＜0.05）；各剂量组大鼠肝组织FXR、SHPmRNA都低于正常组水平。模型组大鼠肝组织SREBP-1c、FAS mRNA水平较正常组显著增加（P＜0.01）；TFHL高、中、低剂量组大鼠肝组织SREBP-1cmRNA水平较模型组明显下降（P＜0.05）。TFHL高、中剂量组大鼠肝组织FAS mRNA水平较模型组明显下降（P＜0.05），但各剂量组大鼠肝组织SREBP-1c、FASmRNA都高于正常组水平。见图3。

图1 各组大鼠肝组织脂肪沉积的变化（油红O×400）

图2 各组大鼠肝脏组织病理的变化（HE×400）

图3 TFHL对NAFLD大鼠肝组织FXR、SHP、SREBP-1、FAS基因mRNA表达的影响(n=8)

2.5 TFHL对NAFLD大鼠肝组织FXR、SREBP-1c、FAS蛋白表达的影响：NAFLD模型组大鼠肝组织FXR蛋白含量较正常组显著减少（P＜0.01）；TFHL高、中、低剂量组大鼠肝组织FXR蛋白含量较模型组明显增加（P＜0.01），但都低于正常组水平。模型组大鼠肝组织SREBP-1c蛋白含量较正常组显著增加（P＜0.01）；TFHL高、中、低剂量组大鼠肝组织SREBP-1c蛋白含量较模型组明显减少（P＜0.05），但都高于正常组水平。模型组大鼠肝组织FAS蛋白含量较正常组有增加趋势；TFHL高、中、低剂量组大鼠肝组织FAS蛋白含量较模型组有减少趋势，但均无统计学差异（P＞0.05）。见图4。

图4 TFHL对NAFLD大鼠肝组织FXR、SREBP-1c、FAS蛋白水平表达的影响(n=8）

3 讨论

随着人民生活水平的提高，NAFLD的发病率也在逐渐升高。NAFLD与糖尿病、心脑血管疾病密切相关，被认为是代谢综合征在肝脏的表现[4-5]。而FXR可以调节胆汁酸、糖、脂的代谢。FXR是配体激活的转录因子，通过调节靶基因的表达调控胆汁酸、脂质和糖的代谢[6]。在肝脏，FXR通过诱导SHP的表达，下调胆汁酸合成途径中的关键酶胆固醇-7α-羟化酶（CYP7A1），从而控制胆固醇转变为胆汁酸[7-8]。同时，FXR通过SHP下调SREBP-1c的表达，SREBP-1c可调节相关成脂基因的水平，包括脂肪合成酶(FAS)、乙酰辅酶A羧基酶等，从而实现FXR对肝脏甘油三酯水平的调控[9]。FXR还能调节磷脂转移蛋白的表达，加速磷脂和胆固醇从富含TG的脂蛋白向高密度脂蛋白（HDL）转运；上调肝细胞膜上的清道夫受体B，从而增加HDL介导的胆固醇逆转运。因此，激活FXR就能发挥抑制胆汁酸的合成、降低甘油三酯等多种药理活性[10]。对于NAFLD的治疗，近年来的临床报道显示中医药的疗效值得肯定，如桂祖全等[11]采用健脾化痰活血法为主治疗非酒精性脂肪性肝病肝郁脾虚证68例，总有效率90.16%，临床疗效良好。TFHL在临床上主要用于降血脂、降血糖、改善脂肪肝、抗心绞痛、抗肿瘤等多种疾病的防治方面。有研究表明，TFHL作为药用植物山楂叶的提取物，可以调节NAFLD/NASH大鼠脂质代谢紊乱，调控Nrf2及相关因子的表达，缓解NAFLD/NASH大鼠的氧化应激，减少脂质过氧化，增强机体抗氧化能力，减少细胞因子对肝细胞的损伤等[12]。

本实验模型组肝组织出现典型的NAFLD病理表现，血清和肝组织TG、CHOL含量增加，血清ALT、AST等水平增高，同时大鼠肝组织FXR、SHP表达显著下降，而SREBP-1c、FAS表达则明显增加，表明长期高脂饮食可导致大鼠肝组织FXR的表达下降，SHP水平受到抑制，进一步促进SREBP-1c、FAS的表达，影响肝脏脂质代谢的平衡，TG、CHOL等在肝脏沉积，肝酶水平升高，提示肝脏FXR表达降低可能是脂肪肝形成的重要机制，FXR-SHPSREBP-1c-FAS通路参与高脂诱导的NAFLD的发生发展。应用TFHL干预后，大鼠肝组织FXR、SHP表达明显增加，而SREBP-1c、FAS表达显著减少，同时TG、CHOL含量和血清ALT、AST水平显著下降，表明TFHL可能通过增加FXR的表达，诱导SHP，抑制SREBP-1c、FAS的过表达，从而改善肝脏脂质代谢和肝功能紊乱，防止NAFLD的进展。研究提示，TFHL可能是通过调控FXR与SREBP-1c通路，改善肝脏脂质代谢紊乱发挥防治NAFLD的作用。