LDH-A乙酰化在结直肠腺癌组织中的表达及意义△

郑鸿，祝子华

1复旦大学附属肿瘤医院闵行分院化疗科，上海200240

2复旦大学附属闵行医院消化科，上海2011990

大多数情况下，肿瘤细胞对葡萄糖的摄入量明显高于正常细胞，即使在不缺氧的情况下也是优先发生糖酵解，从而产生乳酸，这种现象称为Warburg效应[1]。乳酸脱氢酶A（lactate dehydrogenase-A，LDH-A）是糖酵解的重要代谢酶，有研究表明，和正常组织相比，LDH-A在很多肿瘤组织中呈高表达，例如结肠癌、肺癌、乳腺癌等，提示LDH-A与肿瘤的发生、发展存在着密切的关系[2-4]。既往对于LDH-A的研究主要集中在转录水平方面，随着蛋白质修饰的研究成为热点，LDH-A的乙酰化研究日渐深入，根据已有的质谱数据，LDH-A存在8个潜在的乙酰化位点[5]。Zhao等[10]进一步发现LDH-A的乙酰化主要发生于LDH-A第5位点赖氨酸残基上，LDH-A乙酰化能够影响LDH-A酶的活性和蛋白稳定性，还能够促进LDH-A通过分子伴侣介导的溶酶体途径降解，在胰腺癌中LDH-A的乙酰化水平降低，由此使得LDH-A酶活力增加和LDH-A积累，从而促进了肿瘤的能量代谢，加速了肿瘤的生长和转移。有关LDH-A乙酰化与结直肠腺癌关系的报道较为少见。本研究探讨了LDH-A乙酰化在结直肠癌组织中的表达情况，并分析了LDH-A乙酰化与结直肠腺发生、发展的相关性，现报道如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料

选取2016年1月至2017年5月由复旦大学附属闵行医院提供的结直肠腺癌患者的结直肠腺癌组织标本。纳入标准：患者均经手术切除和病理学检查确诊为结直肠腺癌；患者的临床资料完整。排除标准：原位癌患者；具有第二原发肿瘤病史的患者；混合性腺磷癌患者。根据纳入及排除标准，本研究共纳入结直肠腺癌患者40例。40例结直肠腺癌患者中，男26例，女14例；年龄为42～91岁，中位年龄为68岁；分化程度：中高分化24例，低分化16例；临床分期：Ⅰ～Ⅱ期12例；Ⅲ～Ⅳ期28例。另选取相应的40例癌旁正常组织（距癌组织﹥5 mm）标本作为对照。

1.2 方法

1.2.1 指标检测方法 乙酰化LDH-A抗体由复旦大学生命科学研究院提供。检测方法：免疫组织化学检测。具体操作：①脱蜡水化，用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）冲洗3次，每次2 min。②抗原修复，用PBS冲洗3次，每次2 min。③滴加100 μl的过氧化物酶封闭剂，室温下孵育10 min，用PBS冲洗3次，每次2 min。④滴加100 μl的一抗，室温下孵育30～60 min，PBS冲洗3 min，每次2 min。⑤滴加100 μl的二抗（乙酰化LDH-A抗体按1∶10 000稀释），室温下孵育1～2 h。PBS冲洗3 min，每次2 min。⑥配制二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）工作液，取DAB色原和DAB缓冲液各50 μl，加入 1 ml蒸馏水，混匀备用。⑦取 100 μl的DAB工作液滴加在组织胶片上显色2～10 min。⑧自来水冲洗，终止显色。⑨用苏木紫染色液复染，分化，返蓝。⑩显微镜下观察染色结果，并对阳性染色面积进行分析并拍照。

1.2.2 结果判定标准 在显微镜下观察结直肠腺癌组织中乙酰化LDH-A蛋白的阳性表达情况，比较不同临床特征结直肠腺癌患者乙酰化LDH-A蛋白的阳性表达情况。免疫组化结果判定：乙酰化LDH-A蛋白主要表达于细胞浆，部分表达于细胞核，呈现棕黄色颗粒即为阳性表达。在200倍显微镜下，每张组织切片随机选择3个视野，由两名病理科医师在未知任何病理资料和临床资料的情况下对免疫组织化学染色结果进行评估。染色强度评分标准：无染色为0分，染色强度弱为1分，染色强度中等为2分，染色强为3分；阳性细胞所占百分比评分标准：﹤5%为0分，5～25%为1分，26～50%为2分，51～75%为3分，﹥75%为4分。两项评分的乘积为最终得分，0～7分则为阴性表达，8～12分则为阳性表达。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0软件对数据进行统计分析。计数资料以率（%）表示，组间比较采用χ2检验。以P﹤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乙酰化LDH-A蛋白表达情况的比较

结直肠癌组织中的乙酰化LDH-A蛋白阳性表达率为22.5%（9/40），低于癌旁正常组织的47.5%（19/40），差异有统计学意义（χ2=5.50，P﹤0.05）。

2.2 不同临床特征结直肠癌患者乙酰化LDH-A蛋白表达情况的比较

Ⅰ～Ⅱ期结直肠腺癌组织标本中乙酰化LDHA蛋白的阳性表达率高于Ⅲ～Ⅳ期的结直肠腺癌组织，差异有统计学意义（χ2=3.97，P﹤0.05）。不同年龄、性别、分化程度结直肠腺癌患者中乙酰化LDH-A蛋白的阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P﹥0.05）。（表1）

表1 不同临床特征结直肠癌患者乙酰化LDH-A蛋白表达情况的比较

3 讨论

近年来，结直肠癌的发病率呈逐渐上升趋势，但其发病的确切机制尚不明确。肿瘤能量代谢的改变是恶性肿瘤细胞重要的代谢特征[6]。与正常细胞相比，肿瘤细胞显著的代谢特点是肿瘤细胞能够通过葡萄糖酵解大量摄取葡萄糖，从而产生能量以满足其增殖的能量需求，并产生较多的乳酸。乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）是一种糖酵解酶，在肿瘤细胞糖酵解过程中具有重要的作用。在肿瘤细胞中，大部分的丙酮酸不是作为能量原料进入线粒体进行三羧酸循环和氧化磷酸化来产能的，而是经LDH转变为乳酸，通过糖酵解满足肿瘤的快速生长的；过量的乳酸对细胞外基质具有分解破坏的作用，促进了肿瘤细胞与间质细胞的相互作用，有利于肿瘤细胞的浸润与转移，并诱导肿瘤血管的形成[7-8]。因此，肿瘤的生长与LDH密切相关。LDH是一个多基因位点的同工酶，其中，LDH-A是其中的一种亚基类型。LDH-A的表达水平越高，患者的预后越差。Le等[8]报道了在肿瘤患者体内通过RNA干扰LDH-A或药物抑制LDH-A能够阻止肿瘤的进展。Fantin等[9]发现肿瘤细胞中的LDH-A水平下降，肿瘤的生长受到抑制，荷瘤小鼠的存活期延长。LDH-A抑制剂则能够减少肿瘤细胞中腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）的产生，增强细胞内的活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，促进肿瘤细胞的调亡，从而抑制肿瘤的生长[10]。这些研究均说明了LDH-A在肿瘤的代谢和肿瘤的发生中发挥了重要的促进作用，并可能成为潜在的肿瘤治疗靶点。

然而，以往的研究主要集中于LDH-A转录水平的调控。但近年来，细胞中基因转录、信号转导、生物代谢和物质运输等各种途径都离不开蛋白质翻译后修饰的调控。其中，蛋白质的乙酰化作为一种重要的翻译后修饰受到越来越多的关注，如非组蛋白的乙酰化，尤其是代谢酶的乙酰化研究成为热点。这些代谢酶参与细胞中的各种代谢途径，如糖代谢、脂类代谢、氨基酸代谢等，从而影响细胞代谢和疾病的发生。乙酰化调控代谢酶的方式多种多样，例如调节代谢酶的催化活性，影响代谢酶的蛋白稳定性，控制代谢酶的亚细胞定位等，从而影响细胞的代谢和疾病的发生。

本研究结果表明，结直肠癌组织中的乙酰化LDH-A蛋白阳性表达率为22.5%（9/40），低于癌旁正常组织的47.5%（19/40）（P﹤0.05）。这表明乙酰化LDH-A可能对肿瘤细胞的增殖发挥了负性调控作用，提示采用乙酰化类似物替代内生性的LDH-A可能降低肿瘤细胞的增殖能力。这与相关研究发现在胰腺癌中，乙酰化LDH-A不仅能够减少LDH-A的催化活性[10-11]，还能够降低LDH-A蛋白的表达水平的结论相一致。这一现象可能为今后临床靶点治疗提供新思路。

此外，本研究还发现，Ⅰ～Ⅱ期结直肠腺癌患者的结直肠腺癌组织中乙酰化LDH-A蛋白的阳性表达率高于Ⅲ～Ⅳ期结直肠腺癌患者（P﹤0.05）。不同年龄、性别、分化程度结直肠腺癌患者的结直肠腺癌组织中乙酰化LDH-A蛋白的阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P﹥0.05）。表明在结直肠腺癌早期，其LDH-A乙酰化的表达水平高于结直肠腺癌晚期，提示LDH-A乙酰化可能在结直肠癌的发展中存在一定的下调。

综上所述，本研究结果发现结直肠腺癌乙酰化水平在结直肠癌组织中呈低表达，提示其与结直肠癌的发生可能存在一定的关系，LDH-A乙酰化可能在结直肠癌的发展中起到负性调节的重要作用，即LDH-A乙酰化可能抑制结直肠腺癌的发生和发展。