不同浓度富血小板血浆治疗膝关节骨性关节炎临床疗效研究*

王一帆，李小峰，罗道明，蔡金宏，杨 渊

1.云南省文山州中医医院(文山 663000)，2.广西骨伤医院骨四科(南宁 530001)， 3.广西医科大学附属琅东医院骨科(南宁 530001)

主题词 骨关节炎,膝/治疗 富血小板血浆/治疗应用 注射，关节内

膝关节骨性关节炎(Knee osteoarthritis,KOA)是一种以膝关节肿痛、活动障碍为主要临床表现,以膝关节软骨、软骨下骨退行性变及周围组织无菌性炎症为主要病理变化的骨科常见疾病，其症状多表现为膝红肿痛、上下楼梯痛、坐起立行时膝部酸痛不适。本病好发于中老年人群，并且随着现今社会人口老龄化及肥胖人群的增加，患病人数日益攀升，是严重危及中老年人健康的慢性进行性疾病之一[1]，也是老年人出现膝关节疼痛及功能障碍的主要原因[2-3]。现今治疗方法多样，有较多学者针对“生长因子+支架材料”思路选择富血小板血浆(Platelet rich plasma，PRP)治疗KOA在临床取得了积极的治疗效果，但目前尚未有针对适宜血小板浓度PRP治疗KOA的报道。本研究通过对在广西骨伤医院自体疗法中心接受PRP治疗的KOA患者进行前瞻性临床随机对照研究，分析不同血小板浓度PRP对KOA患者的疗效，通过临床观察评分在一定程度上探索出最佳富血小板血浆使用浓度范围。

资料和方法

1 一般资料 选择2015年1月至2016年10月在广西骨伤医院自体疗法中心就诊并符合纳入标准病例64例。纳入标准：符合《骨关节炎诊治指南》(2007年版)[4]膝关节骨性关节炎的诊断标准,且影像学分级符合Kellgren-Lawrenc分级[3]中Ⅰ级-Ⅲ级；排除标准：其他相关疾病波及膝关节或患有严重的心脑血管疾病等研究影响结果者。将纳入患者按随机数字表法先随机分为A、B、C、D组。终末随访时B、C组分别失访2、3例患者,均未能联系到患者，予剔除。最终纳入病例59例,所有患者均完成9个月随访，各组患者在性别、年龄、病程、Kellgren-Lawrence分级等方面比较差异无统计学意义 (P>0.05)，见表1。

表1 各组患者年龄、性别、病程及Kellgren-Lawrwncn比较

2 自体富血小板血浆制备方法 由患者肘正中静脉抽取患者静脉血20ml后置入高速离心机(美国sigma公司 D37520)，参考Aghaloo法[5-6]二次离心，第一次以离心力275×g离心10min后于超净工作台内用1ml注射器配7号注射器针头抽取上清、交界层、交界层下少许红细胞，移入无菌离心管，第二次以离心力870×g离心15min后用1ml注射器配7号注射器针头去除上层贫血小板血浆(必要时去除底部少量红细胞层)后得到2.2ml富血小板血浆。将0.2ml富血小板血浆用0.9%氯化钠注射液稀释至2ml后送检验科急查富血小板血浆中血小板浓度，根据各组浓度将所获得的富血小板血浆以0.9%氯化钠注射液(国药准字 H11020510)稀释至目标范围后留取2ml加入10%氯化钙(国药准字 H51023149)0.2ml激活富血小板血浆中的血小板(各组患者富血小板血浆的制备均由同一组有经验的医师严格按照无菌操作要求完成)。

稀释PRP需加入0.9%氯化钠注射液计算方法：

(获得PRP血小板浓度×2ml)/(2ml+需要加氯化钠体积)=所需PRP浓度范围中间值

3 治疗方案 各组均口服依托考昔片(国药准字J20130133)，作为基础治疗(30mg/次，1次/d，持续2周)。所有患者均根据分组分别接受不同浓度的PRP治疗。A组富血小板血浆中血小板浓度(900～1200)×109/L，B组富血小板血浆中血小板浓度(1200～1500)×109/L，C组富血小板血浆中血小板浓度(1500～1800)×109/L，D组富血小板血浆中血小板浓度(1800～2100)×109/L。每7天重复一次膝关节注射治疗，持续6周。所有注射前不应用局部麻醉药(利多卡因或其他)，注射后被动屈伸活动患者膝关节3～5次，建议患者治疗后休息2d，1周内避免过度负重行走及剧烈活动。告知患者治疗后出现膝关节临时的酸胀、疼痛等反应属于正常，但如果持续的红肿热痛等情况，需及时返院复诊。

4 观测指标 ①治疗前及治疗后3、6、9个月时回访病人，按照美国西部Ontario和Mc aster大学骨关节炎指数评分(WOMAC骨关节炎指数评分) 、国际膝关节文献委员会膝关节评估表(IKDC评分)、VAS视觉疼痛评分评定疗效[4,7]。②观察患者不良反应出现情况。

5 盲 法 因治疗者无法设盲，故仅对受试对象、结局评估者及数据统计者设盲。试验过程中注意对受试对象及结局评估者采取隐藏盲法。试验结束后进行揭盲,由统计分析人员完成数据录入以及统计分析报告。

结 果

1 治疗前后三组VAS、IKDC、WOMAC评分比较 三组治疗后的VAS、IKDC、WOMAC评分比较，差异均有统计学意义(VAS评分：F= 3.982,P=0.012；IKDC评分：F=3.076，P=0.035；WOMAC评分：F= 4.944,P=0.004；),其中，治疗后在不同随访时间点C组VAS评分改善均优于A组 (P<0.01)，治疗后3个月时优于B组 (P<0.05)，D组治疗后第6、9个月随访，评分优于A组 (P<0.05)；C组治疗后所有随访时间点WOMAC评分改善均优于其他三组，差异有统计学意义 (P<0.05)，A、B、D组在治疗后各随访时间点WOMAC评分无统计学差异 (P>0.05)；C组治疗后所有随访IKDC评分改善均优于A组及D组,治疗后第6个月。第9个月时随访IKDC评分改善均优于B组，差异有统计学意义 (P<0.05)，D组治疗后第3个月随访，较B、C组评分差，差异有统计学意义 (P<0.05)。三组各项评分均有随时间变化的趋势(VAS评分：F=55.925，P<0.001；IKDC评分：F=30.667，P<0.001；WOMAC评分：F=34.763，P<0.001)，B、C、D组患者治疗后所有随访时间点评分均优于治疗前 (P<0.05)，A组患者治疗终末随访时VAS评分、IKDC评分与治疗前无统计学差异 (P>0.05)，同时VAS、IKDC、WOMAC评分的分组及时间均存在交互效应(VAS评分：F交互=2.234，P=0.048.001；IKDC评分：F=2.882，P=0.010；WOMAC评分：F=2.934，P=0.011)，见表2～4。

表2 各组中治疗前后各组VAS评分

注：同A组相比，▲P<0.05；同B组相比，△P<0.05；同C组相比，#P<0.05；同治疗前比，&P<0.05

表3 各组中治疗前后各组IKDC评分

注：同A组相比，▲P<0.05；同B组相比，△P<0.05；同C组相比，#P<0.05；同治疗前比，&P<0.05

表4 各组中治疗前后各组IKDC评分

注：同A组相比，▲P<0.05；同B组相比，△P<0.05；同C组相比，#P<0.05；同治疗前比，&P<0.05

2 两组患者治疗后出现不良情况 所有纳入研究患者关节内、注射位置均未出现感染等严重并发症。共计59例膝关节354次膝关节注射中有38次出现短暂的膝关节酸胀痛，短期局部皮肤温度上升等不适，但所有患者予膝关节冰敷及休息等处理后症状均在3d(平均1.81±0.79d)内消失，不良反应发生率为10.73%(38/354)。

讨论

膝骨性关节炎(KOA) 是以受累关节软骨持续进行性变性及破坏，同时伴随关节周围组织的无菌性炎症引起关节周围组织病理性重塑为主要特征的骨科常见退行性疾病。年龄增大会伴随软骨细胞能量代谢异常，及软骨日益磨损而引起关节软骨破坏[8]，导致本病高发老年中老年人群，是我国老年人致畸致残的重要因素。且目前本病的发病率正随着社会的老龄化和肥胖人口的增多而日益攀升，在美国的一项调查结果显示本病发病率仅次于心血管疾病[9]。因其发病率高，晚期致残风险大而与癌症、心血管疾病一起被世界卫生组织列为人类健康三大“杀手”。其高发病率、长期的治疗费用高及疗效欠佳已经成为急需解决的难题。

目前对早期根治本病尚无良策，仅能延缓病情的发展[10]。现代医学对膝骨关节炎的治疗思路主要为修复关节软骨(内外源性修复及基因修复等)和抗炎对症处理。但常用的口服药和关节内注射药物因疗效有限或副作用等并没有取得足够满意的效果[11-13]。手术治疗亦有一定的疗效，但因创伤等因素在临床使用中未必能够广泛推广且适应症有待进一步探讨[14-16]；直到近年再生医学的兴起且有人提出使用“生长因子+支架材料”以组织工程化软骨的方式促进软骨修复，是促进KOA病人损伤软骨修复的新手段[17-18]。在课题组前期的研究证实了PRP治疗KOA的安全有效性[19]。且研究认为PRP对于KOA的治疗作用机制之一就是通过血小板释放的生长因子促进软骨再生修复以及关节周围炎症反应的调节。但通过对文献的研究发现对于临床使用PRP中血小板的适宜浓度无可靠的临床研究证据。

本研究通过对临床使用PRP治疗KOA的临床疗效进行了进一步的随机临床对照研究，发现PRP对于KOA患者VAS评分改善以C组最明显，在不同随访时间均优于A组，治疗后3个月优于B组，说明PRP能够有效减轻患者疼痛症状，且以C组效果明显；对于WOMAC评分C组在治疗后不同随访时间均以C组为优，另对于IKDC评分A、B、D组治疗后组间比较评分无差异，但C组均优于A、D组，治疗后6个月开始优于B组，说明在缓解疼痛基础上，PRP能够有效改善KOA患者关节功能，且不同浓度呈现疗效区别，呈一定剂量依赖表现。另外随着时间推移，各评分均提示出现疗效降低，但C组相对降低缓慢，A组甚至在终末随访与治疗前比较无明显差异。

PRP是将患者静脉血经离心得到的高血小板浓度制品，因其来源于患者自身，取材方便，无毒，无免疫原性反应，制备简便等优点在组织损伤修复领域获得广泛应用。基础研究早在1998年就已经证实其含有大量生长因子并逐步运用于临床[20]，这些生长因子可以促进成骨(软骨)细胞的增殖，抑制破骨细胞的功能，并能诱导软骨和骨基质的合成，促进软组织愈合。PRP进入关节腔后经激活剂激活，通过血小板的脱颗粒作用，促使α颗粒中的大量生长因子缓慢释放，促使蛋白聚糖、二型胶原、SOX-9等特异性基质的分泌而参与到软骨修复过程中来[21-23]，并且可以通过一系列的细胞因子机制将起源于周围正常软骨的多形软骨细胞激活修复损伤软骨[24]；其它多能干细胞也能被激活并参与软骨的修复。理论上PRP中血小板浓度越高，获得的生长因子浓度越高，对于软骨修复再生越有积极作用。有研究对比使用不同血小板浓度的PRP体外培养骨髓间充质干细胞增殖活性发现，不同浓度的PRP均能在一定程度上促进骨髓间充质干细胞的增殖分化，并且随着加入PRP的浓度增加，骨髓间充质干细胞的增殖能力逐渐加强[25]；杜刚等人通过PRP与骨髓间充质干细胞复合物对兔软骨缺损模型进行修复，发现兔软骨缺损修复的程度和使用的PRP浓度呈一定的线性关系[26]；同样，也有学者通过体外研究发现PRP对成骨细胞的促增殖呈剂量依赖性，最佳血小板浓度为(800～1000)×109/L[27]；有学者在软骨细胞的培养基中加入不同比例的PRP，发现软骨细胞增殖分化的能力及细胞表型的保持与添加PRP的剂量呈相关表现[28-30]。因此提高PRP中的血小板衍化生长因子(Platelet derived growth factor，PDGF)、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)等促进软骨细胞自身分裂增殖并长大后实现的软骨内修复，并刺激软骨膜下或者软骨下骨的细胞生长分化形成，完成软骨外修复。以达到修复KOA患者关节软骨，改善关节功能是治疗重点，但本研究结果与上述结论存在一定分歧，结果显示并非一味的提高血小板浓度以获得高浓度的生长因子就能持续增加PRP的疗效，这与现有的其他部分研究报道有一定相似性，Marx等[20]认为不低于5倍血小板浓度的富血小板血浆对于关节软骨才具有积极作用，但是报道认为增加血小板倍率并不能绝对增加软骨增殖能力，有研究显示PRP对人肌腱细胞培养中刺激其增殖、迁移及胶原合成的最适宜浓度为(500～1000)×109/L，当血小板浓度为2000、3000×109/L时增殖能力明显减弱[31]。人体的PRP有效浓度界限为(503～1729)×109/L，当血小板浓度超过1800×109/L时其促进组织再生修复的能力明显减弱，甚至表现出抑制效果[32]。分析其原因有学者认为局部血小板浓度过高，意味着较多的细胞毒素将会影响生长因子的活性[33]，另外PRP中不止含有促软骨再生及抗炎生长因子，部分细胞因子对软骨细胞再生及炎症修复呈负面影响，如转化生长因子-β(Transforming growth factor-β，TGF-β)虽然能促进软骨修复，但其含量过多将会抑制骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic protein,BMP)合成，从而减少促进软骨细胞分化能力[34]。因此我们可以认为PRP治疗KOA的临床使用中有一个最佳血小板应用浓度范围，低于这个范围可能达不到最佳疗效，而浓度过高可能会起到抑制软骨修复的效果。

另外膝关节骨性关节炎的疾病发展过程不止涉及到软骨的破坏，还有一系列炎症因子介导的关节周围软组织重塑[35]。而膝关节内注射PRP治疗膝关节骨性关节炎的研究也认为PRP之所以能够在治疗KOA中起到积极的作用主要是减少了白细胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)、前列腺素2(Prostaglandin 2，PGE 2)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)等可诱发本病且导致机体疼痛的主要因子[36]，从而发挥了抗炎作用[37]。另外有学者根据获得的PRP中白细胞含量提出了富白细胞富血小板血浆和贫白细胞富血小板血浆的分类[38]，而根据其定义，本研究中使用的PRP为富白细胞富血小板血浆，含有较高浓度的白细胞。在膝关节腔内注射PRP使得较多白细胞进入关节腔，可诱导多种炎症调节因子在损伤部位聚集，直接作用在关节腔内以调节局部的炎症反应，从而达到抗炎并修复组织的作用[39-40],但本研究中使用的高浓度的PRP中白细胞的浓度随之上升，当大量的白细胞进入关节腔后必然释放更多的IL-1、IL-6、PGE2及TNF-α等，所介导的无菌性炎症反应程度KOA病变发展程度密切相关[41]，并可能导致新的软骨损伤，从而对抗了生长因子对软骨的修复作用。另外较白细胞浓度的上升将导致局部IL-1、IL-6、PGE2及TNF-α等炎症因子的浓度升高，引起患者治疗后出现膝关节疼痛症状出现反跳[19]，这也可能示本研究中PRP治疗KOA的疗效存在一个“顶浓度”而非绝对剂量依赖的原因之一。

本研究结果分析，不同血小板浓度的富血小板血浆对膝骨性关节炎患者的疗效在一定程度上呈剂量依赖，最适宜浓度可能为(1500～1800)×109/L。部分患者出现膝关节红肿疼痛等反应，与注射的富血小板血浆中白细胞及红细胞浓度较高有关，通过冰敷、休息等处理后均短期明显缓解，且未见治疗后出现感染、血栓等严重并发症，综上所述，自体富血小板血浆关节腔注射治疗膝骨性关节炎安全有效。其临床使用最适宜血小板浓度为(1500～1800)×109/L。但贫白细胞富血小板血浆与富白细胞富血小板血浆对于临床疗效是否存在差异及针对PRP中如何提高“积极细胞因子”浓度，减少“消极细胞因子”干扰等问题有待深入探讨。