克雷伯杆菌肺炎致多器官功能障碍小鼠模型的建立与评价研究*

李 猛,王志梅,徐红日,王成祥△,马战平

1.陕西省中医医院(西安 710003),2.陕西中医药大学(咸阳 712000), 3.北京中医药大学第三附属医院(北京 100029)

主题词 肺炎,细菌性/并发症 克雷伯菌感染 外器官功能衰竭/病理学 模型，动物 小鼠

多器官功能障碍综合征(Multiple organ dysfunction syndrome,MODS)是指机体遭受严重感染、创伤、休克等过程中的严重并发症，病死率随着功能障碍器官系统的增加而上升。在呼吸系统疾病中细菌性肺炎是诱发MODS的主要诱因，肺炎克雷伯杆菌是占第三位的常见致病菌，老年人或免疫功能低下者容易发生。机体感染后，若治疗不及时，容易进一步出现全身炎症反应综合征(Systemic inflammatory response syndrome,SIRS)，进而导致MODS的发生[1-2]。国内外研究者正在积极寻找MODS新的治疗途径，如细胞因子、基因治疗、免疫治疗等，虽治疗技术有很大提高，但其病死率仍居高不下[3]。因此，建立克雷伯杆菌肺炎致多器官功能障碍小鼠模型，对于细菌性肺炎导致的MODS的发病机制和临床药效学研究有重要意义。

材料和方法

1 材 料

1.1 动物:SPF级KM雄性小鼠64只，鼠龄4周，体重(20 ± 5)g，由河南省实验动物中心提供(合格证号XK20110013)。标准饲养，自由饮水。

1.2 药品：肺炎克雷伯杆菌由中国生物制品检验鉴定所提供(菌株号：K46114)，使用前用无菌生理盐水稀释至1.0 × 103CFU/ml。

1.3 主要试剂与仪器：丙氨酸转氨酶(Alanine transaminase，ALT)(批号：20170503)、谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase，AST)(批号：20170504)、GOT试剂盒由南京建成生物工程研究所提供；肌酸激酶同工酶(Creatine kinase isoenzymes，CK)-MB(批号：L170329067)、CK-M(批号：L170329060)、肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor，TNF)-α(批号：EK0527)、白介素(Interleukin，IL)-6(批号：EK0411)、酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测试剂盒由武汉云克隆科技股份有限公司提供。HE染色试剂盒(批号：G1120)由北京索莱宝科技有限公司提供。TP1020全自动组织脱水机、EG1150石蜡包埋机、RM2145型自动切片机(Leica，德国)；OLYMPUS-DP70型显微镜及显微照相系统(奥林巴斯，日本)；Image-Pro Plus6.0专业图像采集及分析系统(Media Cybernetics，美国)；UV-260自动分光光度计(岛津，日本)。

2 研究方法

2.1 分组与造模：将64只小鼠随机分为对照组、模型组，每组32只。参照文献[4-6]提供的方法制备小鼠肺炎模型：采用10%水合氯醛溶液，按0.1 ml/10 g剂量腹腔注射麻醉小鼠。将麻醉好的小鼠仰卧于鼠板上，用胶带固定小鼠四肢，用细线固定小鼠上颌，左手轻轻将小鼠舌头拉出、上提，打开口腔，用照射灯(冷光源)对准小鼠颈部，即可清晰看到小鼠声门开合。在小鼠声门打开时，迅速将气管插管插入气管，并立即拔出针芯，避免窒息。将棉絮置于插管口部，当出现棉絮随呼吸摆动，且与小鼠呼吸节律一致，提示气管插管成功。取0.1 ml配制好的肺炎克雷伯杆菌菌液快速注入小鼠气道内，并注入少量空气，以确保全部药液进入气管。随后将鼠板直立约30 s，轻轻拍打小鼠背部，使菌液入肺。对照组小鼠采用相同方法注入0.1 ml生理盐水。

2.2 取材与指标检测

2.2.1 一般情况：观察小鼠饮食、活动度、呼吸、皮毛光泽度、精神状态、尿量等情况。

2.2.2 血液：分别于造模后第1、3、5、7天每组各取8只小鼠，摘眼球采集血液，分离血清，-80℃冰箱保存备用。采用ELISA法，检测小鼠心肌酶谱CK-MB、CK-M水平(单位：ng/ml)；采用微板赖氏法酶标仪定量，检测小鼠肝功能ALT、AST水平(单位：U/L)。以上操作均严格按照产品说明书进行。

2.2.3 肺脏、心脏、肝脏：小鼠处死后，开腹、开胸取出肺脏、心脏、肝脏，右肺、心脏、肝脏分别用4%多聚甲醛固定液固定，待做苏木素-伊红(Htoxylin eosin，HE)染色；左肺进行组织匀浆，分离上清液，-80℃冰箱保存备用，采用ELISA法，检测小鼠肺组织TNF-α、IL-6水平(单位：pg/ml)；取固定好的右肺、心和肝脏组织，经脱水、透明、浸蜡、包埋，切成4 μm厚的切片，常规HE染色，光学显微镜下观察各脏器组织病理学改变。

2.3 统计学方法：所有数据用SPSS 22.0软件进行统计处理，以均数±标准差表示，采用独立样本t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 一般情况 对照组小鼠在实验期间饮食正常，动作活泼敏捷，呼吸节律平稳，皮毛柔软致密，光亮润泽，精神状态良好，尿量正常；模型组小鼠造模后第1天饮食明显减少，活动减少，呼吸急促、困难，胸腔起伏加剧，毛发蓬松无光泽，精神萎靡，尿量明显减少；造模后第3天，小鼠饮食量及活动量较第1天稍增加，呼吸仍较急促，毛发光泽度及精神状态较差，尿量增加；第5天，小鼠饮食及活动量增加，呼吸稍促，活动稍增，毛发光泽度稍差，精神状态不佳，尿量较正常稍减；第7天，小鼠饮食、活动度、呼吸、皮毛光泽度、精神状态、尿量等情况基本恢复正常。

2 两组血清CK-MB比较 与对照组比较，模型组小鼠在感染后第1、3天血清CK-MB含量显著升高(P<0.01)；第5、7天，CK-MB有升高趋势(P>0.05)，见表1。

3 两组血清CK-M比较 与对照组比较，模型组小鼠在感染后第1、3天，心肌酶谱CK-M含量显著升高(P<0.01)；第5、7天，CK-M有升高趋势(P>0.05)，见表2。

4 两组血清ALT比较 与对照组比较，模型组小鼠在感染后第1天，肝功能ALT含量显著升高(P<0.01)；第3、5、7天，ALT有升高趋势(P>0.05),见表3。

5 两组血清AST比较 与对照组比较，模型组小鼠在感染后各时间点的血清AST含量均有升高趋势，但无显著差异(P>0.05)，见表4。

6 两组炎性细胞因子比较

6.1 两组肺组织TNF-α比较:与对照组比较，模型组小鼠在感染后第1、3天，肺组织TNF-α的含量显著增高(P<0.01)，见表5。

6.2 两组肺组织IL-6比较:与对照组比较，模型组小鼠在感染后第1、3天，肺组织IL-6的含量显著增高(P<0.05或P<0.01)，见表6。

表1 两组不同感染时相小鼠血清CK-MB的变化比较(ng/ml)

注:与对照组比较，*P<0.01。

注:与对照组比较，*P<0.01。

表3 两组不同感染时相小鼠血清ALT的变化比较(U/L)

注:与对照组比较，*P<0.01

表4 两组不同感染时相小鼠血清AST的变化比较(U/L)

表5 两组不同感染时相各组小鼠肺组织TNF-α比较(pg/ml)

注:与对照组比较，*P<0.01

表6 两组不同感染时相各组小鼠肺组织IL-6比较(pg/ml)

注: 与对照组比较，*P<0.05,△P<0.01

7 各组组织形态学比较

7.1 肺组织病理改变：肉眼可见，对照组肺脏呈均匀粉红色，表面光滑，弹性好，未见病损灶；模型组肺脏深红色，可见广泛点状、片状出血灶，充血、水肿、体积增大。

显微镜下，对照组小鼠各时相肺泡结构完整，肺泡腔清晰，肺泡腔及肺泡间隔无明显增厚(图1A、B)。模型组小鼠造模后第1天，大部分肺泡破解融合、结构不完整，部分肺泡塌陷，肺泡间隔明显增厚，充血水肿明显，肺泡腔及肺间质可见大量炎性细胞浸润(图1C)；第3天，部分肺泡破解融合、结构不完整，肺泡间隔增厚，中度充血水肿，肺泡腔及肺间质中等量炎性细胞浸润(图1D)；第5天，少部分肺泡破解融合，部分肺泡间隔增厚，轻度充血水肿，肺泡腔及肺间质可见少量炎性细胞浸润(图1E)；第7天，部分肺泡腔及肺间质可见少量炎性细胞浸润，肺组织大致恢复正常(图1F)。

A：对照组，× 200；B：对照组，× 400；C：模型组第1天，× 400；D：模型组第3天，× 400；E：模型组第5天，× 400；F：模型组第7天，× 400

图1 各组小鼠肺组织代表性病理照片

7.2 心肌组织病理改变：大体可见，对照组心脏组织为淡红色，无肿胀、充血；模型组心脏组织肉眼所见为暗红色，体积增大，可见广泛瘀血点。

显微镜下，对照组小鼠试验期间心肌组织形态大致正常(图2A、B)。模型组小鼠造模后第1天，心肌纤维断裂、排列紊乱，间质纤维组织增生，小血管周围可见大量炎症细胞浸润(图2C)；第3天，部分心肌纤维断裂、排列紊乱，可见间质纤维组织增生，小血管周围可见中等量炎症细胞浸润(图2D)；第5天，少部分心肌纤维断裂、排列紊乱，小血管周围可见少量炎症细胞浸润(图2E)；第7天，心肌组织大致恢复正常(图2F)。

7.3 各组肝脏病理改变:大体可见，对照组肝脏红润，无肿胀、充血；模型组肝脏肉眼所见为深褐色，稍显充血。

镜下可见，对照组小鼠各时间点肝组织形态大致正常(图3A、B)。模型组小鼠造模后第1天肝细胞肿胀，肝窦狭窄、瘀血，可见炎性细胞浸润(图3C)；造模后第3天部分肝细胞肿胀，可见肝窦狭窄、瘀血，炎性细胞浸润(图3D)；造模后第5天少部分肝细胞肿胀、肝窦狭窄、瘀血，可见少量炎性细胞浸润(图3E)；造模后第7天肝组织大致恢复正常(图3F)。

A：对照组，× 200；B：对照组，× 400；C：模型组第1天，× 400；D：模型组第3天，× 400；E：模型组第5天，× 400；F：模型组第7天，× 400

图2 各组小鼠心肌组织代表性病理照片

A：对照组，× 200；B：对照组，× 400；C：模型组第1天，× 400；D：模型组第3天，× 400；E：模型组第5天，× 400；F：模型组第7天，× 400

图3 各组小鼠肝脏组织代表性病理照片

讨论

细菌性肺炎是临床上常见的肺部感染性疾病，肺炎克雷伯杆菌是导致细菌性肺炎的主要致病菌，多见于老年人或免疫功能低下的患者，近年来耐药率有增加趋势，是院内感染的重要原因，其死亡率高达40%[7]。老年人或免疫功能低下者出现细菌性肺炎需要及时治疗，否则很难自行好转，甚至容易引起MODS或MOF等较为严重的并发症而致死[8]。

MODS发生机制较为复杂，目前主要围绕炎性反应失控、凝血/纤溶系统失衡、氧化/抗氧化系统失衡等方面进行研究[9]。炎症反应失控是MODS主要的发病机制，MODS是众多炎性介质、细胞因子大量释放和相互作用所造成的失控性全身炎症反应的最终表现[10]。肺是老年多器官功能障碍的启动器官，这与肺自身的组织结构及生理功能密切相关[11]。肺部感染后，大量炎性介质和炎性因子的释放，诱发炎症级联反应，引起肺损伤，一方面炎症介质通过损伤的肺泡上皮细胞、肺毛细血管内皮细胞进入血液循环，对心脏、肝脏等其它脏器造成直接损伤，进而诱发全身炎症反应综合征；另一方面肺部损伤后诱发严重低氧血症，引起心肌细胞及肝细胞骤然缺血缺氧，加重心脏、肝脏损伤[12]。本组资料显示，感染后第1天、第3天模型组小鼠CK-MB、CK-M、ALT水平较对照组显著升高。对肺脏、心脏、肝脏组织病理变化的动态观察显示，在感染后第1天、第3天模型组小鼠各脏器组织病理损伤明显，尤以第1天损伤更为明显。提示该模型可造成小鼠肺脏、心肌以及肝脏组织损伤。

在感染所致MODS的动物模型研究方面，国内外研究者也通过大量实验建立了多种MODS实验模型[13]。盛志勇等[14]根据复制MODS动物模型的经验，结合人类MODS诊断依据，曾提出过MODS诊断标准，但尚无统一和公认的诊断标准。动物MODS诊断标准的核心要求是动物致伤24h后出现两个或两个以上器官功能障碍者即可考虑MODS动物模型造模成功。国内学者既往对MODS的研究主要集中在MODS的肠启动机制方面，提出了如盲肠结扎穿孔术、大肠杆菌腹腔注射法、肠系膜上动脉缺血法等方法制备MODS模型[15]，但对MODS的肺启动机制研究尚在探索阶段。本实验结果显示，模型组小鼠感染后第1天、第3天，呼吸窘迫，肺组织病理损伤明显；心肌酶CK-MB、CK-M水平均显著高于对照组，心肌和肝脏组织病理损伤明显。ALT、AST较对照组升高，提示心肌和肝功能损伤，但肝损伤相对较轻。提示，本实验中在肺炎克雷伯杆菌引起多器官功能障碍综合征过程中肺脏、心脏、肝脏均有所损伤，以肺、心损伤程度较为明显。因此，复制以肺功能障碍为首发的动物模型，对于由肺炎或肺损伤引起的MODS研究可提供较好的基础。

近年来，对MODS的认识已由"感染"模式转变为"炎症"模式。研究发现，MODS的发病与急性肺损伤(Acute lung injury，ALI)和急性呼吸窘迫综合征(Acute respiratory distress syndrome，ARDS)密切相关；而失控性全身炎症反应综合征(SIRS)是ALI→ARDS→MODS发展过程中共同的发病基础[16]。肺部感染后，刺激巨噬细胞产生，激活多种炎症细胞或效应细胞，释放大量的炎症介质或细胞因子，释放氧自由基和脂质代谢产物等，引起炎症级联反应，诱发失控性SIRS，导致肺泡上皮细胞、肺血管内皮细胞损伤，引起ALI，严重者导致ARDS，最终诱发MODS而死亡[17]。机体发生SIRS的同时还释放大量内源性抗炎介质，当抗炎反应占优势时则发生"代偿性抗炎症反应综合征(Compensatory antiinflammatory response syndrome，CARS)"。若SIRA/CARS平衡，则内环境稳定；SIRA/CARS失衡，则引起组织和器官的损害。总之，SIRS、CARS均反应了炎症反应失控，这是导致MODS发生的根本原因[18]。本实验结果显示，模型组小鼠在感染后第1天、第3天肺组织炎性因子TNF-α、IL-6水平明显升高，在感染后第1天即出现严重的组织病理损伤，尤以肺脏、心脏为主。

本实验采用气管插管法滴入肺炎克雷伯杆菌后，迅速出现肺、心肌、肝脏的器官功能损伤，这一过程比较符合由肺炎发展而来的多器官功能障碍的临床特征，适用于细菌性肺炎导致的MODS发病机制和临床药效学的研究。