短梗五加茎黄酮对2型糖尿病模型小鼠降糖作用初步研究*

华 莹

珠海霍普金斯医药研究院股份有限公司(珠海 519000)

主题词 五加 糖尿病，2型/药物疗法 生物黄酮类/药物作用 糖尿病，实验性 模型，动物 小鼠

短梗五加(Acanthopanax sessiliflorus Seem)又称五加参、无梗五加，系五加科五加属落叶灌木或小乔木植物[1-2]。原产地主要是分布于我国的东北黑龙江密山市完达山支脉-青梅山、吉林省安图市和抚松县、辽宁省千山以及俄罗斯和朝鲜[1-2]。短梗五加中的主要活性成由黄酮类、皂苷、木脂素、挥发油、有机酸等组成[3]。2008年国家卫生部已经批准短梗五加为新能源食物，其茎既是传统的食用珍品，更是具有降血糖、降血脂、强心、健胃利尿的药用保健佳品[4-9]。

近年来，对于天然中药植物中的成分研究成为了热点，利用食补替代药补成为了健康保健品产业的发展趋势。本研究为了探讨短梗五加茎黄酮(Flavonoid of acanthopanax sessiliflorus Seem，FASS)对2型糖尿病(Type-II Diabetes mellitus，IIDM)及其并发症的治疗作用，首先利用高糖高脂日粮结合注射一定剂量的链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)建立2型糖尿病(Non-insulin dependent diabetes mellitus，NIDDM)模型Balb/C小鼠，然后对模型小鼠进行不同剂量的FASS和二甲双胍药物作为阳性对照灌胃处理，从而研究FASS对2型糖尿病小鼠降糖效果，不仅为日后开发天然降糖药物提供基础数据支持，更可以为长白山地区短梗五加中其它药用活性成分的利用提供技术参数。

材料与方法

1 材 料 本研究材料为2017年5月中旬采自吉林省安图市林场(129.07 E；43.08N)的短梗五加茎，经鉴定为短梗五加(Acanthopanax sessiliflorus Seem)的茎。链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)，购于美国索莱宝公司；二甲双胍缓释片(Metformin hydrochloride sustained release tablets，MHSRT)，购于中美上海施贵宝制药有限公司；总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)等检查试剂盒，购于上海生物工程试剂有限公司；其他生化试剂，购于国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯。

170只健康Balb/C小鼠(雌雄各半)，体重(20.0 ± 1.0)g，购于吉林大学小动物中心。将Balb/C小鼠饲养于标准化动物实验室内，室内通风条件良好，昼夜变化正常，相对湿度在50%～65%，室温在19 ～ 23 ℃。在建立2型糖尿病(Non-insulin dependent diabetes mellitus，NIDDM)模型小鼠前适应性饲养7 d。常规日粮，购于吉林省长春市实验动物饲料公司，其中蛋白质含量为20%、碳水化合物含量为55%、脂肪含量为8%和纤维素含量为10%。高糖高脂日粮，由本实验筛选获得，1000 kg的高糖高脂日粮的配方是由690 g/kg常规日粮，添加150 g/kg的蔗糖、150 g/kg的猪油和10 g/kg胆固醇组成。

2 实验方法

2.1 短梗五加茎黄酮的提取：取短梗五加嫩茎烘干至恒重，研磨粉碎，过60目筛，精确称量1.0 g，按照料液比1∶5浸泡在85%乙醇处理12～14 h，再在35℃条件下超声波处理1 h，然后用索氏回流提取2次，每次3～5 h，收集合并提取液，旋转蒸发浓缩至膏状。加入500 ml的蒸馏水溶解浓缩物，再加入等量的石油醚萃取，共计萃取5次，最后收集水相层溶液并置于恒温水浴上蒸至100 ml，利用冻干机冷冻干燥过夜，最后收获得到短梗五加黄酮粗干燥粉末。

2.2 2型糖尿病小鼠模型(NIDDN)的构建：取170只健康Balb/C小鼠，严格标记并测定体质量，更换饲喂本实验室筛选配置好的高糖高脂日粮24 d，然后用5.0 mg/ml STZ(现用现配)以20 mg/kg的注射剂量进行腹腔注射处理，记录注射处理的时间，72 h后测定小鼠血糖值，当测定的小鼠血糖值大于12.0 mmol/L时，可判定该小鼠为2型糖尿病小鼠模型(NIDDN模型小鼠)。同时，记录模型小鼠的生理状态，这时的模型小鼠与普通小鼠相比具有多食、多饮、多尿等常规生理状态的变化出现。

2.3 实验分组：随机取NIDDN模型小鼠50只，分成5个小组(每组10只)，将其分成：模型空白对照组(DC组)、FASS剂量组(FASSL组)、FASS高剂量组(FASSH组)、二甲双胍缓释片(M组)以及正常的健康普通的Balb/C小鼠作为空白对照组(NC组)。NC组和DC组每天灌胃500 μl dH2O，FASSL组每天灌胃100 mg/kg的短梗五加茎黄酮，FASSH组每天灌胃300 mg/kg的短梗五加茎黄酮，M组每天灌胃500 μl含有5 mg/kg的二甲双胍缓释片。按照《中药药理研究方法学》关于人与小鼠体表面积计算获得饲喂量对5个实验组连续灌胃24 d，整个实验重复3次，共计150只小鼠。

2.4 小鼠生理生化指标的检测：五组小鼠分别在未灌胃、灌胃6 d、灌胃12 d、灌胃18 d和灌胃24 d，5个阶段进行空腹尾部静脉采血，利用血糖仪测定血糖值，检测3次血糖值并记录。当第25天时，对五组小鼠进行体质量测定并记录，然后进行活体眼眶取血，再进行颈部脱劲处死，按照各个生理生化指标试剂盒检测总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的含量，重复检测3次并记录。

2.5 短梗五加茎黄酮对小鼠相关基因表达的影响：提取小鼠肝脏的总RNA，并利用试剂盒合成小鼠肝脏cDNA，置于-20℃冰箱中保存备用。根据NCBI查询2型糖尿病的候选基因：胰岛素受体(Insulin receptor-related receptor，INSRR)、肝细胞核因子(Hepatocyte nuclear factor-1-alpha，HNF1A)和葡萄糖转运子10(Glucose transporter 2，GLUT10)的序列，设计荧光定量PCR引物，见表1。再利用荧光定量PCR检测这3个基因在小鼠肝脏中的表达量，实验重复3次。最后利用SDS 2.3软件对测定的结果进行数据分析，并计算2-ΔΔCT，获得3个基因的表达情况。

3 统计学方法 运用SPSS 23.0统计学软件，计量方法以“平均值±标准差”的形式表示，采用t检验，多组间的差异分别采用的是ANOVA单因素方差分析。当P<0.05时具有统计学差异。

表1 小鼠中2型糖尿病的候选基因的实时荧光定量PCR引物

结 果

1 灌胃前后小鼠生理状态的观察与体质量的测定 对灌胃前后五组小鼠进行生理状态观察，在连续灌胃24 d后，NC组小鼠生理状态良好，表现为小鼠的饮食和饮水量正常，反应灵敏。DC组小鼠生理状态出现了明显变化，主要表现为小鼠的饮食和饮水量相对增大，其排尿量也出现增多并出现腹泻粪便稀的状态，精神萎靡，反应迟钝。FASSL组、FASSH组以及M组小鼠生理状态也出现了与DC组小鼠类似的变化，但是表现程度相比DC组轻一些。

由图1可知，短梗五加茎黄酮对五组小鼠体质量的影响。当建模前时，五组小鼠的体质量之间不存在差异(P>0.05)；当建模后灌胃前时，DC组、FASSL组、FASSH组和M组这四组小鼠与NC组相比，小鼠的体质量之间均存在显著增加差异(P<0.05)；当建模后灌胃后时，FASSL组、FASSH组和M组这三组小鼠与DC组相比，小鼠的体质量之间均存在显著降低差异(P<0.05)。因此，从上述结果可以确定：短梗五加茎黄酮可以控制2型糖尿病(NIDDM)模型小鼠的体质量的增长。

A：表示各组与正常对照组(NC组)相比，体质量存在统计学差异(P<0.05)；B：表示各组与模型对照组(DC组)相比，体质量存在统计学差异(P<0.05)

图1 短梗五加茎黄酮对五组小鼠体质量的影响

2 短梗五加黄酮对2型糖尿病模型小鼠血糖的影响 见表2。由表2可知，五组小鼠在未灌胃时，除正常对照组(NC组)以外，其他四组小鼠的血糖值不存在统计学差异(P>0.05)；在灌胃6 d时，FASSH组和M组的小鼠血糖值与DC组相比，存在明显降低，有统计学差异(P<0.05)；在灌胃12 d时，FASSL组、FASSH组和M组的小鼠血糖值与DC组相比，存在明显降低，有统计学差异(P<0.05)；在灌胃18 d时，FASSL组、FASSH组和M组的小鼠血糖值变化与灌胃14 d时变化趋势相同；在灌胃24 d时，FASSH组和M组与正常空白对照组(NC组)的小鼠血糖值相比，不存在统计学差异(P>0.05)。因此，通过小鼠灌胃实验可以说明，短梗五加茎黄酮可以有效的降低2型糖尿病模型小鼠血糖，从而改善小鼠高血糖病症。

3 短梗五加黄酮对2型糖尿病模型小鼠血脂的影响 由图2可知，随着灌胃到达24 d，FASSL组中TC和TG含量水平、FASSH组中TC和TG含量水平以及M组中TC、TG和LDL-C含量水平，与NC组小鼠的三个指标的含量水平相比，均存在着上升趋势，有统计学差异(P<0.05)；FASSL组、FASSH组以及M组中TC、TG和LDL-C含量水平，与DC组小鼠的三种指标的含量水平相比，均存在着降低趋势，有统计学差异(P<0.05)。因此，通过小鼠灌胃实验可以说明，短梗五加茎黄酮可以有效的降低2型糖尿病模型小鼠血脂，从而调节小鼠血脂代谢紊乱状态。

A：表示各组与正常对照组(NC组)相比，血脂含量存在统计学差异(P<0.05)；B：表示各组与模型对照组(DC组)相比，血脂含量存在统计学差异(P<0.05)

图2 短梗五加茎黄酮对五组小鼠血脂的影响

4 短梗五加茎黄酮对小鼠相关基因表达的影响 由图3可知，荧光定量PCR数据表明：在FASSL组、FASSH组和M组中影响2型糖尿病的INSRR、HNF1A和GLUT10基因的表达与两个对照组相比都存在着显著提高，从而可以在基因表达层面上解释，短梗五加茎黄酮对小鼠灌胃处理后，可以显著促进糖尿病相关基因的表达，通过提高相关基因的表达使得小鼠血糖浓度降低，因此短梗五加茎黄酮可以调控2型糖尿病的INSRR、HNF1A和GLUT10基因的表达，来调节血糖浓度。

表2 短梗五加茎黄酮对五组小鼠血糖的影响(mmol/L)

注：各组与正常对照组(NC组)相比，*P<0.05；各组与模型对照组(DC组)相比，#P<0.05

A：表示各组与正常对照组(NC组)相比，基因表达量存在统计学差异(P<0.05)；B：表示各组与模型对照组(DC组)相比，基因表达量存在统计学差异(P<0.05)

图3 短梗五加茎黄酮对小鼠相关基因表达的影响

讨论

短梗五加与人参均为五加科植物，已经引起国内外的广泛关注， 天然的食药性中药植物已经成为目前世界研究的活性成分分析的热潮。虽然国内外学者在五加属植物的生物学、化学、药理学、基因组学等方面研究取得了一定的成果[12]，这不仅为短梗五加茎开发利用及食药性保健品的研发奠定了基础，更为中药现代化产业化打下了坚实数据基础。

2型糖尿病的发病机理主要是为胰岛素抵抗(IR)和胰岛素分泌缺陷而非胰岛B细胞自身免疫破坏，而高血糖是2型糖尿病的主要病症之一[10-11]。控制体内高血糖是减少和控制2型糖尿病以及其并发症的主要办法之一[12-13]。本研究结果发现，短梗五加茎黄酮能够有效的降低2型糖尿病模型小鼠的病症，短梗五加茎黄酮高剂量组(FASSH组)具有较好的降低血糖的疗效，其效果与二甲双胍缓释片的效果相接近。已经有研究表明黄酮类化合物可以促进肝脏中外源葡萄糖的利用，从而具有降低血糖的作用，而本实验可以推断短梗五加茎黄酮能够有效的降低血糖水平，可能是通过促进利用外源葡萄糖的双向调节利用，或者是短梗五加茎黄酮可以从某种程度刺激胰岛素分泌降低血糖。同时，我们利用了荧光定量PCR实验，验证了短梗五加茎黄酮，可以促进2型糖尿病的INSRR、HNF1A和GLUT10基因的表达，从而从基因表达调控角度研究短梗五加茎黄酮调控血糖的机制，但是本研究还处于初步研究，有待于日后进一步深入的研究。

短梗五加茎黄酮可以控制2型糖尿病(NIDDM)模型小鼠的体质量的增长，也可以有效的降低2型糖尿病模型小鼠的血糖和血脂，同时还可以调控小鼠中相关2型糖尿病的INSRR、HNF1A和GLUT10基因的上调表达，从而调节血糖浓度，这不仅改善高血糖病症和缓解血脂代谢紊乱的问题提供了研究基础，更为日后医药研究提供了基础数据。