响应面法优化提取无花果干果中 多酚和总黄酮物质及其抗氧化活性

张锦华,徐 蔓,白宝清,董 晨

(山西大学生命科学学院,山西太原 030006)

无花果(FicuscaricaL.)系桑科落叶小乔木,是一种普遍生长的物种[1],特别是在温暖干燥的气候中[2]。无花果中富含矿物质、维生素和膳食纤维,无胆固醇,并且含有大量的氨基酸[3]。与其他水果相似,无花果中含有丰富的糖类,含量最多的是葡萄糖、果糖、阿拉伯糖和半乳糖。而糖和淀粉会发生互变,往往会影响其口感和质量。无花果中富含酚类物质,对其品质有重要作用,特别是已被证明可对人体健康产生积极影响[4-5],能够有效清除自由基、保护机体生物大分子以及抗肿瘤、抗动脉硬化等。无花果中同时含有黄酮类化合物,具有很好的化学反应性,例如能够清除生物体内的自由基,具有抗氧化作用[6]。

目前国内对无花果的研究主要集中在无花果叶中活性物质的提取,新鲜无花果以及干无花果活性物质的研究较少。国外对新鲜无花果和干无花果研究较多,Mostapha等[7]利用不同质量分数丙酮对浅色和深色干无花果中的酚类化合物进行提取,得到浅色和深色干无花果中总酚最大提取量分别为469.46、399.79 mg/100 g。Mostapha等[8]又利用响应面法对深色新鲜无花果酚类化合物提取进行优化,最终得到总酚提取量为536.43 mg/100 g。

新鲜无花果极易腐烂,因此大部分产品为干无花果,干无花果是世界上产量最高的水果产品之一。本文以干无花果为研究对象,通过响应面优化出干无花果中多酚和总黄酮类物质提取的最优工艺,并且将其与VC进行抗氧化活性比较,同时考察模拟人体内微环境对无花果多酚抗氧化活性的影响,为干无花果中活性物质的有效提取提供理论依据和应用基础,并为进一步研究干无花果中活性物质组成提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

无水乙醇、正己烷、氯仿、乙酸乙酯、甲醇 天津市进丰化工有限公司;福林酚 北京索莱宝科技有限公司;Na2CO3、NaNO2、Al(NO3)3、NaOH、NaH2PO4、Na2HPO4天津市光复科技发展有限公司;铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、FeSO4、水杨酸、H2O2、Tris、HCl、KH2PO4天津市风船化学试剂科技有限公司;邻苯三酚 天津市光复精细化工研究所;以上试剂均为分析纯;没食子酸标准品、芦丁标准品、胃蛋白酶(酶活>250 U/mg)、胰蛋白酶(酶活>250 U/mg) 上海融禾医药科技有限公司;DPPH 美国Sigma公司;无花果干果 购于太原市美特好超市。

UV-2800型紫外可见分光光度计 尤尼柯(上海)仪器有限公司;GZX-9023MBE型电热鼓风干燥箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;JA1203N型电子天平 上海精密科学仪器有限公司;SC-3614型低速离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司;RE-52AA型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;SHZ-Ⅲ型循环水真空泵 上海知信实验仪器技术有限公司;XL-600B型多功能粉碎机 永康市小宝电器有限公司;SB-4200DT型超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原料预处理 无花果干果切小块,在55 ℃烘箱放置24 h后,粉碎过60目筛,备用。

1.2.2 提取工艺 称取经预处理的原料(1.000±0.002) g放置于250 mL锥形瓶中,按料液比加入乙醇水提取溶剂,在设定的温度和时间下进行超声波辅助提取[9]。提取完成后将粗提液经抽滤后进行减压浓缩,并用蒸馏水定容至25 mL,得到提取物原液,4 ℃冰箱冷藏。

1.2.3 单因素实验 固定条件为提取溶剂乙醇的体积分数60%,料液比1∶40,超声温度50 ℃,超声时间50 min,分别改变提取溶剂乙醇的体积分数、料液比、超声温度和超声时间,从而考察各变量对无花果干果中多酚和黄酮提取量的影响。研究中各因素的变化范围分别为:乙醇体积分数为40%、50%、60%、70%、80%;料液比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60;超声温度为30、40、50、60、70 ℃;超声时间为30、40、50、60、70 min。

1.2.4 Box-Behnken试验设计 在单因素试验的基础上,选取乙醇体积分数、料液比、超声时间和超声温度四个因素进行进一步优化,按照Box-Behnken试验设计因素和水平,以总酚和总黄酮提取量为指标通过响应面分析确定最优提取条件。如表1所示。

表1 Box-Behnken试验因素水平Table 1 The factor levels of Box-Behnken design

1.2.5 多酚含量测定 参考文献[10],在760 nm处测量吸光度值。以没食子酸对照品的质量浓度(mg/mL)为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线为Y=91.25X-0.0055,R2=0.9996。结果以每克无花果干果中含有相当于没食子酸毫克数表示,单位为mg/g。

1.2.6 总黄酮含量测定 参考文献[11],在510 nm处测量吸光度值。以芦丁对照品的质量浓度(mg/mL)为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线为Y=4.8749X+0.0218,R2=0.9983。结果以每克无花果干果中含有相当于芦丁毫克数表示,单位为mg/g。

1.2.7 抗氧化能力测定

1.2.7.1 还原能力测试 以最佳提取条件下的提取液为原液,参考文献[12],在700 nm处测定吸光度值。以VC做对照试验,重复测量求平均值,吸光度越高,则还原能力越强。

1.2.7.2 羟自由基清除率测定以最佳提取条件下的提取液为原液,参考文献[13],在510 nm处测样品及对照品VC的羟自由基清除能力,结果如:

式中:A1为空白对照组吸光度(蒸馏水代替待测液);A2为样品组吸光度;A3为干扰组吸光度(蒸馏水代替水杨酸)。

1.2.7.3 DPPH自由基清除能力测定 以最佳提取条件下的提取液为原液,参考文献[14],在517 nm处测样品及对照品VC的DPPH自由基清除能力,结果如:

式中:A1为样品组吸光度;A2为干扰组吸光度(无水乙醇代替DPPH);A3为空白组吸光度(无水乙醇代替待测液)。

1.2.7.4 超氧阴离子自由基清除率测定 以最佳提取条件下的提取液为原液,参考文献[15],在320 nm处测样品及对照品VC的超氧阴离子自由基清除能力,结果如:

式中:A0为空白对照组吸光度(蒸馏水代替待测液);A1为样品组吸光度;A2为干扰实验组吸光度(蒸馏水代替邻苯三酚)。

1.2.8 人工模拟胃肠液处理对无花果提取物抗氧化活性影响 本实验进行了人工模拟胃肠液的体内消化微环境,为无花果干果黄酮提取物体内功能性实验提供数据指导[16]。参考相关文献[17],人工胃液配制方法如下:量取1 mol/L稀盐酸溶液16.4 mL,加入800 mL蒸馏水,再加入10.0 g胃蛋白酶,混匀后定容至1000 mL。人工肠液配制方法如下:称取6.8 g的KH2PO4,加入500 mL蒸馏水,用0.1 mol/L的NaOH调节pH至6.8,再加入10.0 g胰蛋白酶,定容至1000 mL。

取最优条件下无花果干果提取物溶液5 mL(其中黄酮质量浓度为5 mg/mL),分别加入到50 mL人工胃液和82.5 mL人工肠液中,其中人工胃液处理组在37 ℃条件下,130 r/min(模拟体内胃蠕动)恒温摇床振荡70 min,人工肠液处理组在37 ℃条件下,45 r/min(模拟体内肠蠕动)恒温摇床振荡120 min,以蒸馏水作空白对照,处理结束后采用100 mL乙酸乙酯萃取3次,合并萃取液旋转蒸发浓缩并用无水乙醇定容至10 mL[18],进行抗氧化活性测定,每组实验重复3次[19]。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 单因素实验

如图1a所示,提取溶剂乙醇的体积分数较低时,无花果干果中多酚和总黄酮的提取量也较少,当采用60%乙醇进行提取时,多酚和总黄酮的提取量均达到最大值(多酚约为2.53 mg/g,总黄酮约为19.34 mg/g),继续增加乙醇体积分数,提取量反而有所降低。这是因为60%乙醇溶液与无花果酚类和黄酮类物质的极性最为接近,作为提取溶剂最为适宜。

图1 单因素对无花果干果多酚和总黄酮提取量的影响Fig.1 Effect of single factors on the yield of polyphenols and total flavonoids注:a.乙醇体积分数;b.料液比;c.超声时间;d.超声温度。

如图1b所示,料液比较小时,随着料液比的增加,多酚和总黄酮的提取量也缓慢增加,当采用料液比为1∶40乙醇进行提取时,多酚和总黄酮提取量达到最大值(多酚约为2.13 mg/g,总黄酮约为19.29 mg/g),料液比高于1∶40时,提取量反而下降。这是因为随着提取溶液的增加,多酚和黄酮物质得到了充分溶出,在1∶40时达到最高,之后随着提取溶液的继续增加,实验误差也逐渐变大,同时考虑溶剂用量和能量损耗,选择料液比为1∶40最为适宜。

如图1c所示,随着超声时间的增加,无花果干果中多酚和总黄酮的提取量也逐渐增加,当提取时间为50 min时,多酚和总黄酮提取量均达到最大值(多酚约为1.84 mg/g,总黄酮约为17.44 mg/g),继续增加超声时间,提取量下降。这是因为随着提取时间的增加,无花果干果中的多酚和黄酮溶出量增多,在50 min时达到最高,之后随着提取时间的继续增加在温度的影响下发生了分解,导致提取量下降。

如图1d所示,超声温度为50 ℃时,无花果干果中多酚和总黄酮提取量达到最大值(多酚约为1.87 mg/g,总黄酮约为16.54 mg/g),提取温度过低时提取量明显下降,提取温度升高时提取量也呈下降趋势。这是因为随着超声温度的升高,分子运动速度加快,有利于多酚和黄酮的溶出,但是酚类和黄酮类物质在长时间高温下会受到一定程度的破坏,因此提取量反而下降。

2.2 响应面优化实验结果分析

2.2.1 Box-Behnken试验设计与结果 以总酚和总黄酮提取量为响应值,根据Box-Behnken设计因素水平编码[20]。结果见表2。

表2 超声波辅助提取干无花果中多酚和总黄酮的响应面试验设计及结果Table 2 Experimental design and results for the response surface analysis to optimize the ultrasonic assisted extraction of polyphenols and total flavonoids from DriedFigs

2.2.2 多酚回归方程方差分析及响应面试验结果 以超声温度、超声时间、料液比、乙醇体积分数作为响应变量,以总酚提取量作为响应值,建立二次回归多元方程如下:Y=2.83+0.075A+0.069B+0.12C+0.047D+0.15AB+0.053AC-0.012AD-0.073BC-0.085BD+0.025CD-0.21A2-0.28B2-0.24C2-0.13D2。

表3 多酚提取响应面模型方差分析Table 3 Analysis of variance of phenol extraction response surface model

各因素交互作用对多酚提取量影响的响应曲面以及等高线如图2所示。响应面图坡度的陡峭程度直观地反映了各因素对响应值的影响,两两因素间均有交互作用,其中超声温度和超声时间交互作用最强,表现为所对应的响应曲面变化较为陡峭;超声时间和乙醇体积分数的交互作用最弱,表现为所对应的的响应曲面较为平缓。

图2 各因素交互作用影响多酚提取量的响应面图Fig.2 Interaction effect of each factor affects the response surface of polyphenol extraction

2.2.3 总黄酮回归方程方差分析及响应面试验结果 以超声温度、超声时间、料液比、乙醇体积分数作为响应变量,以总黄酮提取量作为响应值,建立二次回归多元方程如下:Y=21.83+0.071A+0.33B+0.043C+0.15D+0.39AB+0.67AC+0.020AD+0.29BC-0.10BD-0.18CD-0.67A2-1.78B2-1.37C2-0.74D2。

表4 总黄酮提取响应面模型方差分析Table 4 Analysis of variance of total flavonoids extraction response surface model

各因素交互作用对黄酮提取量影响的响应曲面以及等高线如图3所示。响应面图坡度的陡峭程度直观地反映了各因素对响应值的影响,两两因素间均有交互作用,其中超声温度和超声时间,超声时间和料液比,超声温度和乙醇体积分数以及料液比和乙醇体积分数的交互作用均较强,表现为所对应的响应曲面变化较为陡峭;超声时间和乙醇体积分数的交互作用最弱,表现为所对应的的响应曲面较为平缓。

图3 各因素交互作用影响总黄酮提取量的响应面图Fig.3 Interaction effect of each factor affects the response surface of flavonoid extraction

通过对回归方程式求解,使总酚和总黄酮提取量取最大值得到最优结果一致,为超声时间52.56 min,超声温度51.42 ℃,料液比1∶46.8,乙醇体积分数61.11%。在此条件下,最大多酚提取量2.86 mg/g,最大黄酮提取量21.93 mg/g;考虑到实验室条件,确定最佳提取条件为超声时间52 min,超声温度51 ℃,料液比1∶45,乙醇体积分数为60%,在此工艺条件下,进行三次平行实验,得到多酚提取量为(2.72±0.37) mg/g,黄酮提取量为(20.89±0.57) mg/g。

2.3 无花果干果提取物抗氧化活性比较

2.3.1 多酚提取物抗氧化活性比较 在最佳提取条件下得到无花果干果提取液,计算多酚质量浓度,配制成与VC浓度相同的待测液。进一步比较无花果干果多酚提取物和VC的还原能力、羟自由基、DPPH自由基和超氧阴离子自由基清除能力,结果如图4所示。

图4 无花果干果多酚提取物还原能力(a)、羟自由基(b)、DPPH自由基(c)、超氧阴离子自由基(d)清除能力Fig.4 Total reducing power,hydroxyl,DPPH and super-oxide anion free radical scavenging abilities of polyphenols

由图4可知,无花果干果提取出的多酚具有较强的抗氧化能力,且随着质量浓度的升高而呈递增的趋势。在相同梯度质量浓度条件下,无花果干果中多酚的还原能力,羟自由基和DPPH自由基清除能力均高于VC,原因可能是无花果中的酚类物质在提取和干燥过程中得到了浓缩导致含量或活性的增强[21],或多酚提取物中含有其他抗氧化能力较高的物质,致使其抗氧化能力大大提升;但是对超氧阴离子自由基的清除能力较差,分析原因可能是提取液中其他物质对清除超氧阴离子自由基的拮抗作用。Dewanto 等[22]认为酚类物质常与细胞壁上的物质以结合的方式存在,热加工、巴氏杀菌以及冷冻干燥法等可以使酚类物质从结合态释放出来,导致酚类物质的增加或减少;还有可能是干燥过程中酚类物质发生热分解、被氧化、以及在酶的作用下转化为其他物质或由其他物质转化为酚类物质,导致其含量的变化[23]。

2.3.2 黄酮提取物抗氧化活性比较 在最佳提取条件下得到无花果干果提取液,计算黄酮质量浓度,配制成与VC浓度相同的待测液,进一步比较无花果干果黄酮提取物和VC的还原能力,清除羟自由基、DPPH自由基和超氧阴离子自由基率,结果如图5所示。

图5 无花果干果黄酮提取物还原能力(a)、羟自由基(b)、DPPH自由基(c)、超氧阴离子自由基(d)清除能力Fig.5 Total reducing power,hydroxyl、DPPH and super-oxide anion free radical scavenging abilities of flavonoids

由图5可知,无花果干果黄酮提取物具有较强的抗氧化能力,且随着质量浓度的升高而呈递增的趋势。在相同梯度质量浓度条件下,无花果黄酮提取物的各抗氧化能力均低于VC。其中,无花果黄酮提取物溶液与VC的还原能力和羟自由基清除能力变化趋势相似,随着浓度的增加呈上升趋势,而超氧阴离子自由基清除能力随质量浓度的变化幅度较小,低于同浓度的VC。分析原因可能是VC自身的抗氧化能力较高,无花果干果提取液中的黄酮类化合物与其他物质之间的相互作用,导致抗氧化能力低于VC。

2.4 人工模拟胃肠液处理对无花果干果提取物抗氧化能力影响

经过人工胃肠液处理后,无花果干果提取物的抗氧化能力如表5所示。

表5 人工胃肠液处理对无花果干果提取物抗氧化能力影响Table 5 Effect of artificial gastrointestinal treatment on antioxidant activities of drsedFigs extrocts

由表4可知,经由人工胃液处理以后,提取液的还原能力和羟自由基清除能力显著或极显著升高(p<0.05或p<0.01),而DPPH自由基和超氧阴离子自由基清除能力极显著降低(p<0.01),而经过人工肠液处理后,相应的还原能力和超氧阴离子自由基清除能力显著或极显著提高(p<0.05或p<0.01),而DPPH和羟自由基清除能力极显著下降(p<0.01)。推测可能是由于无花果提取物中具有明显抗氧化活性的黄酮类化合物在模拟胃肠液处理条件下其结构和功能发生了不同的变化,从而导致其活性发生变化。Kamiloglu等[24]认为可能是由于体系中存在的抑制物或辅助因子对黄酮化合物的活性产生了抑制或促进作用。本研究中无花果黄酮为一种粗提物,因此还需进一步对粗品进行纯化,并进行更深入的探讨。

3 结论

采用响应面试验优化无花果干果多酚和黄酮得到最佳提取工艺为:乙醇体积分数60%,超声温度51 ℃,超声时间52 min,料液比1∶45。在此工艺条件下的多酚提取量为(2.72±0.37) mg/g,黄酮提取量为(20.89±0.57) mg/g。体外抗氧化实验表明,在相同质量浓度下,无花果干果中多酚提取物的还原能力、羟自由基清除能力以及DPPH自由基清除能力均高于VC;而黄酮提取物各抗氧化能力均低于VC。模拟胃肠液处理的抗氧化结果表明,经过人工胃肠液处理后,无花果黄酮的抗氧化能力发生了明显变化，推断其与处理后活性物质的结构和功能变化有关。