白灵菇蛋白质的 理化及功能特性

薛 媛,杨 沫,魏君慧,陈怡萌，徐怀德

(西北农林科技大学食品科学与工程学院,陕西咸阳 712100)

白灵菇(Pleurotusnebrodensis)在我国广泛种植,年产量超过18万吨,人工栽培产地遍及南北诸省,其中以豫、津、冀省区生产规模较大[1]。白灵菇子实体肥大洁白,脆嫩可口,香味浓郁,营养丰富[2]。其中,蛋白质含量占干菇的27.14%,氨基酸含量约167.2 g/kg,其中必需氨基酸占氨基酸总量的40.07%[3]。在白灵菇生产过程中产生大量残次白灵菇,其廉价易得且富含蛋白质,但常常被作堆肥或堆肥[4],造成资源浪费。对白灵菇进行深加工,不仅可以提高白灵菇产品的附加值,拓展消费市场,还可以降低菇农栽培风险[5]。目前,白灵菇蛋白质的研究主要集中于蛋白质营养价值[6]、氨基酸风味[7]和蛋白质的生物活性[8-9],而对白灵菇蛋白质理化性及功能特性的研究相对少见。

盐析是蛋白质制备的常用方法,可在纯化蛋白初期迅速浓缩蛋白质,具有分离效果佳、蛋白质不易发生不可逆变性、经济可行等优势[10]。吕蔷等[11]用分段盐析法从双孢蘑菇中分离纯化过氧化物酶;黄志立等[12]用分段盐析法从云芝菌丝体中分离纯化超氧化物歧化酶。

为此,本论文以残次级白灵菇为原料,通过分段盐析法制备白灵菇分段盐析蛋白质组分,并研究分段盐析蛋白质组分的理化性及功能特性,以期为白灵菇蛋白质的综合开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

白灵菇 杨凌康农菌业有限公司;Ellman试剂(DTNB) 美国 Sigma公司;溴化钾 色谱纯,天津市科密欧化学试剂有限公司;β-巯基乙醇 美国Amresco公司;甲醇、乙腈 色谱纯,美国 TEDLA公司;四氢呋喃、三乙胺、结晶乙酸钠、三氯乙酸、Tris、甘氨酸等 均为分析纯。

DHG-9070A型电热鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司;K9840型凯氏定氮仪 海能仪器股份有限公司;FD5-2.5E型冷冻干燥机 武汉天仪海波仪器有限公司;LS55型荧光分光光度计 美国PE公司;Vetex 70型傅里叶变换红外光谱仪 德国布鲁克公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原料的预处理 新鲜残次级白灵菇切条,经40 ℃热风干燥至恒重,粉碎过40目筛,4 ℃密封保存备用。

1.2.2 菇粉基本成分测定 蛋白质的测定:GB/T 15673-2009;粗多糖的测定:苯酚硫酸法[13];粗纤维的测定:GB/T 6434-2006中的过滤法;粗脂肪的测定:GB/T 15674-2009;灰分的测定:GB/T 5009.4-2010。

1.2.3 白灵菇蛋白质的提取分离 称取菇粉50 g,用浓度为5 mol/L的NaOH溶液调节浸提水液至碱性(pH10.0),在料液比1∶15、温度40 ℃条件下浸提2 h,6000 r/min离心20 min,收集上清液,对沉淀物在相同条件下重复浸提,6000 r/min离心20 min,合并两次浸提所得浸提液。向碱性浸提液中逐步加(NH4)2SO4制备分段盐析蛋白质(简写为FPs),具体步骤如下:向碱性浸提液中逐步加入(NH4)2SO4,根据《调整硫酸铵溶液饱和度计算表》,调整盐饱和度依次达60%、80%、90%,4 ℃下静置过夜,6000 r/min离心20 min,依次收集沉淀,分别得60%、80%、90%盐饱和度分段盐析蛋白质(分别简写为F60、F80、F90)。蒸馏水复溶蛋白质,于4 ℃用蒸馏水透析除盐(透析分子量为8000～14000 Da),冷冻干燥。

1.2.4 蛋白质的析出率、含量及多糖含量的测定 采用考马斯亮蓝法[14]测定蛋白质提取率与析出率。

式(1)

式中,c为上清液蛋白质浓度(mg/mL);V为上清液体积(mL);m为菇粉质量(mg);γ为样品中粗蛋白含量(%)(蛋白含量的计算参考国标GB/T 15673-2009)。

式(2)

式中,c1为复溶蛋白质液浓度(mg/mL);V1为复溶蛋白液体积(mL);c为上清液蛋白质浓度(mg/mL);V为上清液体积(mL)。

采用苯酚硫酸法[15]测定粗蛋白质中的多糖含量。

1.2.5 白灵菇蛋白质的分子量测定 制备浓度为15%的分离胶和4%的浓缩胶,进行电泳。低分子质量Marker(14.4～97.4 kDa)。试验初始电压为90 V,待样品进入分离胶后调整为110 V。电泳结束后,采用考马斯亮蓝G250染色30 min,洗脱液脱色至背景清晰。

1.2.6 蛋白质二级结构的分析与测定 采用傅里叶变换红外光谱仪，参照Arogundade等[15]的方法分析蛋白质组分的二级结构。

1.2.7 表面疏水性测定 用磷酸盐缓冲液(0.01 mol/L,pH7.0)分别稀释FPs的蛋白质溶液(4 mg/mL),得浓度范围为0.0625～4 mg/mL的蛋白质稀释溶液。参照Yu等[16]的方法测定表面疏水性。

1.2.8 白灵菇蛋白质的二硫键测定 参照Ma等[17]的方法测定FPs的二硫键。

1.2.9 白灵菇蛋白质内源荧光光谱 采用荧光分光光度计，参考Arogundade等[15]的方法对FPs进行内源荧光光谱分析。

1.2.10 F60的溶解性测定 称取0.1 g F60,分别加入20 mL pH分别为2.2、3.0、3.8、4.0、4.2、5.0、6.0、7.0、8.0的磷酸盐-柠檬酸缓冲液(0.2 mol/L),配制蛋白质溶液(5 mg/mL)。不同pH的蛋白质溶液在37 ℃水浴摇床内保温30 min。6000 r/min离心20 min,采用考马斯亮蓝法测定上清液中蛋白质浓度。蛋白质溶解度表示为上清液中蛋白质占总蛋白质含量的百分比。

1.2.11 F60的乳化性和乳化稳定性测定 参照Poojary等[18]的方法测定F60的乳化性(EAI)和乳化稳定性(ESI)。

1.2.12 F60的起泡性和泡沫稳定性测定 称取0.5 g F60蛋白质样品,加50 mL Tris-HCl缓冲液(0.2 mol/L,pH8.0)配制成浓度为1%(W/V)的蛋白质溶液,倒入量杯。10000 r/min均质2 min静置。分别于0和30 min记录泡沫高度V0和V30。起泡性(FC)和泡沫稳定性(FS)的计算方法如下:

式(3)

式(4)

1.2.13 F60的吸油性测定 称取0.2 g F60于10 mL离心管内,加入5 mL大豆油,搅拌2 min;10000 r/min离心20 min,去除上清,称量每管内沉淀与离心管的质量,吸油性(FAC)的计算见以下公式:

式(5)

式中,F0为样品干重质量(g);F1为样品干重与试管质量之和(g);F2为沉淀与试管质量之和(g)。

1.2.14 F60的体外解离度测定 参照Poojary等[18]的方法测定F60的体外解离度(IVD)。计算方法如下:

式(6)

式中:N0为未水解样品中总氮量;N1为酶解后样品中总氮量。

1.3 数据处理

所有实验均重复三次,每次重复实验进行至少三次平行实验。实验得到的数据用Minitab 16统计软件进行方差分析。结果表示为平均值±标准偏差,并且当p<0.05时认为差异是显著的。采用Excel 2007软件作图。

2 结果与分析

2.1 白灵菇干粉基本成分测定

白灵菇干粉中含有丰富的粗多糖、蛋白质,含量分别为37.48%±1.50%和22.37%±0.84%;粗纤维与灰分含量分别为10.42%±0.39%、5.77%±0.04%;脂肪含量低,仅占干重的0.64%±0.02%。

2.2 白灵菇蛋白质的制备及粗蛋白中蛋白质与多糖含量

白灵菇菇粉碱性条件下浸提蛋白质,浸提液中蛋白质含量达(2046.76±2.60) mg/100 g菇粉,白灵菇菇粉蛋白提取率为9.15%。曹萌等[19]从棘托竹蒜菌盖中用0.1 mol/L NaOH蛋白质提取率为11.89%;彭炜等[20]采用超声波辅助碱法最优工艺提取硒蛋白,提取率为41.13%。较低的提取率可能与食用菌细胞壁组织结构及提取过程中真菌细胞壁的破碎方法有关[21]。

由表1可知,向白灵菇蛋白质提取液中分段加入(NH4)2SO4得FPs,FPs中F60析出率最高,达65.62%,与浸提液中蛋白质浓度越高越易盐析有关[22]。FPs中蛋白质含量范围为44.58%～71.58%,多糖含量范围为25.22%～37.85%。FPs中的蛋白质含量,随着盐析饱和度的增大而增大,F90中蛋白质含量最高,达71.58%。

表1 白灵菇蛋白质的析出率及粗蛋白中蛋白质与多糖含量Table 1 Exhalation rate,protein and crude sugar content of pleurotus nebrodensis proteins

2.3 白灵菇蛋白质的理化特性

2.3.1 白灵菇蛋白质的分子量 白灵菇蛋白质的SDS-PAGE图谱见图1,白灵菇蛋白质分子质量主要集中在21.5～97.4 kDa之间,蛋白质条带数与各条带分子量间存在差异。白灵菇蛋白质组分共同含有分子量为约31 kDa的蛋白质条带,且F90仅富含分子量为31 kDa的一条蛋白质条带,表明这种蛋白质是FPs的主要组成;除共同条带外,F80富含分子量约为50 kDa的大分子量蛋白质条带,F60富含分子量约为14.4 kDa的小分子量蛋白质条带。

图1 白灵菇蛋白质的SDS-PAGE电泳图Fig.1 SDS-PAGE profiles of pleurotus nebrodensis proteins

2.3.2 白灵菇蛋白质的二级结构、表面疏水性与二硫键含量 对傅里叶红外变换光谱进行高斯曲线拟合后,获得白灵菇蛋白质组分的近似二级结构分布,由表2所示。FPs中随着盐饱和度的增大,β-折叠结构出现频率降低,无规则卷曲结构出现频率增加,α-螺旋与β-转角结构出现频率先增加后减小。结果说明,FPs的主要结构为β结构,随着(NH4)2SO4饱和度的增大,可能导致蛋白质局部変性,蛋白质中的β-折叠向无规则卷曲、α-螺旋和β-转角结构转变[23]。

表2 白灵菇蛋白质的二级结构、表面疏水性与二硫键含量Table 2 Relative content of the secondary structural features,surface hydrophobicity and disulfide bond of pleurotus nebrodensis proteins

表面疏水性是反映蛋白质表面与极性环境相接触的疏水基团数目的重要指标[24]。预测不同处理的蛋白质疏水性基团暴露程度的H0如表2所示。FPs中,随着盐析过程中盐饱和度的增加,H0减小;表明F60、F80、F90中与极性环境接触的疏水性基团含量依次减少;可能与盐浓度升高会加剧蛋白质局部变性与疏水性基团聚合有关[25]。也可能是受蛋白质中含有的多糖杂质的影响。油-水界面的相互作用由疏水作用主导,油-水界面中蛋白质暴露的非极性疏水基团对蛋白质乳化性产生影响[26],推断FPs中F60的乳化性、起泡性最优。

二硫键是一种共价键,能使蛋白质肽链的空间结构更为紧密,二硫键等基团间的相互作用,为蛋白质产生维持高级结构和功能提供基础[27]。三种白灵菇蛋白质组分二硫键含量范围为54.77～55.61 μmol/L/g,二硫键含量差异不显著(p>0.05),高于青稞蛋白质[28](42.53～52.54 μmol/L/g)中的二硫键含量;结果表明,F60、F80、F90具有较高且相近的蛋白质稳定性。

2.3.3 白灵菇蛋白质的内源荧光光谱 在激发波长为280 nm的条件下,内源荧光可反映酪氨酸与色氨酸残基所处的蛋白质环境[27],被用于研究蛋白质三级结构的改变[29]。

如图2所示,三种白灵菇蛋白质的发射峰均在344 nm左右。FPs的发射光谱峰值,随着盐饱和度的增大而减小,FPs中出现高度变性的蛋白质可能性增大,随着蛋白质变性,导致大量酪氨酸与色氨酸残基到达亲水性环境。同时,可能与蛋白质中β-折叠结构含量有关,折叠结构含量越高,可将酪氨酸与色氨酸更加紧密地包裹在蛋白质内核疏水性区域[16]。进而推断,FPs间的蛋白质三级结构存在差异。

图2 白灵菇蛋白质组分内源荧光光谱图Fig.2 Intrinsic fluorescence spectra of pleurotus nebrodensis proteins

2.4 F60的功能特性

由表1可知,F60的析出率最高,达65.62%;F60较F80、F90具有较高的表面疏水性,进一步测定其功能特性。

2.4.1 F60的溶解度 由图3可知,在pH为2.2～3.8的范围内,随着pH升高,F60的溶解度减小;在pH为4.2～8.0的范围内,随着pH升高,F60的溶解度增大,在pH8.0的溶解度最大(27.32%)。在pH为2.2～8.0的范围内,F60呈现两次降低、升高趋势,分别在pH3.8、pH4.2溶解度最低,由此推断F60中富含两种等电点分别为pH3.8与4.2的蛋白质组分。

图3 F60蛋白质在不同pH磷酸盐缓冲液中的溶解性Fig.3 Solubility of pleurotus nebrodensis proteins of F60 in phosphate-citrate buffer at different pH values

2.4.2 F60的乳化性、起泡性、持油性及体外解离度 由表3可知,蛋白质的功能特性与蛋白质的感官特性密切相关,目前对食用菌蛋白质的功能特性研究较少,陈雪洋等[30]对杏鲍菇蛋白质的提取与功能特性进行研究,样品溶解度为11.40%,乳化及乳化稳定性指数分别为52.81 m2/g与97.75 min,起泡性与泡沫稳定性分别118.00%与70.26%,持油性为4.22 g/g样品。与杏鲍菇蛋白质相比,除乳化性(EAI、ESI)与FAC,F60的溶解度(27.13%,pH7.0)、FC与FS均优于杏鲍菇蛋白质。此外,F60的体外解离度高于香榧籽蛋白质[18](58.05%～59.05%),易消化水解。F60具有较好的溶解性、起泡性、易消化水解,具有潜在的应用价值。

表3 F60的乳化性、起泡性、持油性及体外解离度Table 3 The functional properties of F60

3 结论

白灵菇干粉中含有丰富的粗多糖、蛋白质,含量分别为37.48%和22.37%;脂肪含量仅占干重0.64%。白灵菇是一种高蛋白、高多糖,低脂肪的食用菌。由碱浸提、分段盐析法制备的FPs,其析出率、蛋白质纯度与理化特性存在差异。F60析出率显著高于F80、F90(p<0.05);F90的蛋白质纯度显著高于F60、F80(p<0.05)。FPs间的二硫键含量无显著性差异(p>0.05),FPs的稳定性相近。FPs的蛋白质条带中共同含有分子量约为31 kDa的蛋白质条带,但FPs间的蛋白质条带组成存在差异。F60较F80、F90富含分子量为14.4 kDa的蛋白质条带,具有较高的表面疏水性与荧光发射光谱峰值,β-折叠结构出现频率更高。F60具有优良的溶解性、起泡性、易消化水解,具有潜在的应用价值。白灵菇蛋白质是一种可用于食品加工的优质蛋白质资源。