植物乳杆菌KLDS 1.0318产酸、耐酸、耐胆盐能力及其免疫特性研究

蒙月月,陆婧婧,占 萌,霍贵成

(东北农业大学乳品科学教育部重点实验室,黑龙江哈尔滨 150030)

免疫力是人体自身的防御机制,是人体识别和消灭外来侵入机体的病毒、细菌等异物,识别和处理损伤、变性、衰老、死亡的自身细胞以及突变和病毒感染细胞的能力。免疫力低下是当机体免疫系统损伤,抵抗疾病能力下降,易导致细菌、病毒等入侵,从而危害人体健康的状态[1-3]。益生菌是指具备生物活性,摄入一定数量时可以改善和调节机体肠道微生物菌群的平衡,对宿主健康产生有益作用的微生物[4]。乳酸菌(Lacticacidbacteria,LAB)是能够发酵糖类物质转化为大量乳酸的一类呈球状或杆状、不产芽孢的革兰氏阳性细菌的统称,是益生菌中最具有代表性的菌属[5-6]。乳酸菌主要包括乳球菌属、乳杆菌属、链球菌属及肠球菌属等,广泛分布在水果、蔬菜、乳、肉以及植物制品中,此外,在人体的胃肠、口腔中也有发现[7-8]。植物乳杆菌属于乳杆菌属,因多数从植物中分离而得名[9]。作为一类人体和动物肠道中正常菌群的益生乳酸菌,植物乳杆菌不仅具有维持体内微生态平衡的作用,还具有免疫调节功能,例如能够提高脾淋巴细胞增殖活性以及调节Th1/Th2细胞、Th17/Treg细胞平衡[10-13]。

然而,人体胃液的强酸性以及肠道的胆盐会严重影响植物乳杆菌的存活能力,植物乳杆菌能在人体内发挥其益生功效的菌体浓度一般是106～109CFU/mL[14]。因此,乳酸菌能否抵御机体低pH的胃酸环境和肠道内高渗透压的胆盐环境是其在机体内存活的关键和发挥益生作用的前提[15]。本研究以植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)KLDS 1.0318为研究对象,旨在评价其作为潜在益生乳杆菌的可能性,研究其生长曲线、产酸速率、耐酸、耐胆盐能力及免疫活性,为后续实验提供数据支持和理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

植物乳杆菌KLDS1.0318 东北农业大学乳品科学教育部重点实验室;雌性BALB/c小鼠 清洁级,6～8周龄,北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证号:SCXK2012-0001,鼠房保持饲养环境温度(23±2) ℃,每天人工灯光照明12 h,标准小鼠饲料喂养,自由饮用蒸馏水;大小鼠标准饲料 辽宁长生生物技术有限公司;牛胆盐 上海蓝季科技发展有限公司;10×磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered saline,PBS) 北京索莱宝科技有限公司;RPMI-1640培养液 美国Hyclone公司;胎牛血清 Vitrocell公司;刀豆蛋白(ConA)、台盼蓝染色液、中性红染色液、红细胞裂解液、Hank’s液 Solarbio公司;CCK-8 日本同仁化学研究所;蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、葡萄糖等其他试剂 分析纯,北京奥博星生物技术有限责任公司。

DHP-9272型电热恒温培养箱 上海一恒科技有限公司;LDZF-50KB-II立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂;HF90型CO2培养箱 香港力康发展有限公司;Model 680型酶标仪 美国Beckman公司;PL2002型、AL104型电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;PHS-25型pH计 上海精密科学仪器有限公司;Lambda Bio35紫外-可见分光光度计 美国Perkin Elme公司;20～200、100～1000 μL可调定量移液枪 德国Eppendorf公司;96孔培养板 美国NEST公司;AE-30倒置生物显微镜 麦克奥迪实业集团有限公司;VD-1320型洁净工作台 北京东联哈尔仪器制造有限公司;LD4-2型低速离心机 北京医用离心机厂。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基的配制 Man-Rogosa-Sharp(MRS)培养基。具体配制方法参照文献[16]。

1.2.2 生长曲线测定 将活化后的植物乳杆菌KLDS 1.0318以2%(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中,置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h,每隔2 h取样,用平板计数法测定活菌数,并在600 nm波长处测定其光密度值(OD600),绘制菌株的生长曲线图。

1.2.3 产酸性实验 植物乳杆菌KLDS 1.0318经活化后,按2%(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中,37 ℃恒温培养箱中培养24 h,每隔2 h取样,用pH计测定其pH。

1.2.4 耐酸性实验 用0.1 mol/L的盐酸将MRS液体培养基的pH调整至1.5、2.5和3.5,121 ℃高压蒸汽灭菌20 min,冷却备用。将活化后的植物乳杆菌KLDS 1.0318以2%(v/v)的接种量分别接种到上述处理后的培养基中,37 ℃恒温培养,分别于0、1、2、3 h取样,采用平板计数法测定活菌数。按下列公式计算存活率[17]。

近日（8月27日-8月31日），中国化肥批发价格综合指数持稳运行。9月3日中国化肥批发价格综合指数（CFCI）为 2193.41点，环比上涨8.48点，涨幅为0.39%；同比上涨288.24点，涨幅为15.13%；比基期下跌185.46点，跌幅为7.80%。

式(1)

1.2.5 耐胆盐实验 在MRS液体培养基中加入牛胆盐,使胆盐的质量浓度分别为0.03、0.3、0.5 g/100 mL,以不添加胆盐的MRS液体培养基作为对照,121 ℃高压蒸汽灭菌20 min,冷却备用。将活化后的植物乳杆菌KLDS 1.0318以2%(v/v)的接种量接种到上述处理后的培养基中,37 ℃恒温培养,分别于0、1、2、3、4 h取样,采用平板计数法测定活菌数。按式(1)计算存活率[17]。

1.2.6 小鼠脾淋巴细胞增殖实验

1.2.6.1 菌悬液的制备 将实验菌株以2%(v/v)的接种量接种至MRS培养基中,37 ℃培养至生长稳定期(12 h),将菌液在4 ℃条件下5000 r/min离心10 min后,用无菌0.01 mol/L、pH7.4 PBS重悬菌沉淀,重复两次,弃去上清液,用含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养液重悬菌沉淀,调整菌悬液浓度均为108CFU/mL,4 ℃冷藏备用。

1.2.6.2 小鼠脾淋巴细胞的制备 颈椎脱臼处死小鼠后,放入盛有75%(v/v)乙醇的烧杯中浸泡3～5 min,在超净台上沿腹腔中线剪开小鼠胸腔,无菌取出脾脏,将其置于200目不锈钢网筛,网筛中央浸没于盛有Hank’s液的平皿中,用无菌注射器芯研磨,用Hank’s液将网上剩余组织吹洗掉,收集脾脏组织悬液于无菌离心管中,1000 r/min离心5 min,弃去上清液,加入2～3 mL红细胞裂解液到洗过的细胞中,混匀后静置2～3 min,待红细胞完全破碎,以1000 r/min离心5 min后弃上清液,以除去血红细胞,用RPMI-1640不完全培养基离心洗涤细胞2次。收集细胞,用含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基重悬细胞,细胞悬液用台盼蓝染色后血球计数板计数,确保活细胞比例不小于95%,计数后用含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基调整脾细胞浓度为1×106个/mL用于实验[18]。

1.2.6.3 植物乳杆菌KLDS 1.0318对脾淋巴细胞增殖的影响 在无菌96孔细胞培养板中,设空白调零组、阴性对照组、阳性对照组、乳酸菌对照组和实验组(实验设计方案如表1所示),使植物乳杆菌KLDS 1.0318与细胞分别以1∶1、10∶1、100∶1比例共同培养)[19]。所有实验均重复3次。加样混匀后,置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中连续培养48 h后,加入新鲜配制成CCK-8溶液20 μL/孔,继续培养4 h,振荡溶解后用酶标仪在450 nm波长处测定OD值,根据下列公式计算脾淋巴细胞转化值和脾淋巴细胞增殖指数(PI)。

表1 实验设计方案

脾淋巴细胞转化值=OD1-OD2

式(2)

式中:OD1为实验组OD值;OD2为阴性对照组OD值。

式(3)

式中:OD1为实验组OD值;OD2为阳性对照组OD值;OD3为乳酸菌OD值;PI>1时提示促进增殖;PI<1时提示抑制增殖。

1.2.7 植物乳杆菌KLDS 1.0318对巨噬细胞吞噬能力的影响 腹腔巨噬细胞的制备[20]:小鼠眼球放血,颈椎脱白处死后,置于75%(v/v)乙醇溶液中浸泡5 min(消毒皮肤,暴露出腹膜壁),酒精擦洗腹部后,用无菌注射器抽取10 mL Hank’s液注入腹腔中,轻柔敲打2 min,使腹腔巨噬细胞尽可能多地悬浮在液体中;另取一支注射器抽出腹腔悬液,收集于无菌离心管中,1000 r/min离心5 min,弃上清液;用RPMI-1640完全培养液吹打细胞使其成为单细胞悬液,血球计数板计数,确保活细胞比例不小于95%,调整细胞浓度为1×106个/mL用于实验。

巨噬细胞吞噬中性红能力测定[21]:将巨噬细胞接种于96孔板(100 μL/孔),细胞在37 ℃、5% CO2培养箱中培养3 h,弃去上清液,贴壁细胞即为巨噬细胞。在每孔重新加入含10%血清的RPMI-1640培养液和终浓度分别为1×106、1×107、1×108CFU/mL的菌悬液各100 μL,使植物乳杆菌KLDS 1.0318与细胞分别以1∶1、10∶1、100∶1比例共同孵育,对照组加等体积的无菌水。细胞在37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h,弃去上清液,加入0.072%中性红染色液100 μL/孔,继续培养30 min,弃去中性红染色液,用PBS清洗3次以除去未被吞噬的中性红溶液,之后加入200 μL/孔细胞裂解液(冰醋酸∶无水乙醇=1∶1,v/v),继续培养2 h,振荡混匀,用酶标仪在540 nm处测定光密度值。

1.2.8 植物乳杆菌KLDS 1.0318对巨噬细胞能量代谢水平的影响 将巨噬细胞接种于96孔板(100 μL/孔),细胞在37 ℃、5% CO2培养箱中培养3 h,弃去上清液,贴壁细胞即为巨噬细胞。在每孔重新加入含10%血清的RPMI-1640培养液100 μL,再加入100 μL重悬于RPMI-1640完全培养液的植物乳杆菌KLDS 1.0318,使菌悬液终浓度分别为1×106、1×107、1×108CFU/mL。细胞在37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h,加入20 μL/孔CCK-8溶液,继续培养2 h,振荡混匀;然后在酶标仪上450 nm处测定各孔吸光值。结果以OD值表示腹腔巨噬细胞能量代谢水平[20]。

1.3 数据统计

所有实验均进行3次重复实验,采用Excel 2010软件处理实验数据及制图,并用统计软件SPSS 22对实验结果进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 植物乳杆菌KLDS 1.0318的生长曲线

由图1可知,植物乳杆菌KLDS 1.0318在0～4 h内增长缓慢,属于迟缓期;在4 h后进入对数期,活菌数迅速增长;在12 h后达到稳定期,此阶段活菌数变化不大;20 h后,活菌数有所下降,进入衰亡期。菌株的OD600值与活菌数对数值的变化趋势基本吻合,在对数期末达到了8.821。

图1 植物乳杆菌KLDS 1.0318的生长曲线

2.2 产酸性实验

产酸能力是乳酸菌活力良好的重要特征之一,由图2可以看出,植物乳杆菌KLDS 1.0318能够在较短时间内足量的产酸,使pH迅速降低,由最初的7.22逐渐下降,在12 h后降至4.16,显示了其较好的产酸能力。

图2 植物乳杆菌KLDS 1.0318的产酸性

2.3 耐酸性实验

由图3可知,植物乳杆菌KLDS 1.0318在pH1.5条件下活菌数下降较快,培养至3 h其活菌数对数值降为零。在pH为2.5和3.5的液体培养基中培养时,活化后的菌体产生应激反应消除了酸胁迫带来的不利影响,一定程度上保持了菌体细胞生长的稳定性[22],1 h后其存活率分别达到了100.70%和103.89%,2 h后活菌数有所下降,但其活菌数对数值均在7以上。培养至3 h时,其存活率分别为91.20%和97.50%。说明了植物乳杆菌KLDS 1.0318具有较好的耐酸能力。

图3 植物乳杆菌KLDS 1.0318对酸的耐受性

2.4 耐胆盐性实验

由图4可知,在胆盐质量浓度为0.03 g/100 mL条件下,随着作用时间的延长,植物乳杆菌KLDS 1.0318活菌数呈现增长趋势,培养至4 h时,其存活率达到了109.73%。说明0.03%的低胆盐浓度所产生的渗透压较小,对菌体细胞活性影响不大,该菌株仍能够保持较好的稳定性并呈增长趋势。菌株在胆盐质量浓度分别为0.3、0.5 g/100 mL条件下培养1 h后,其活菌数均有所下降,说明高浓度胆盐对植物乳杆菌KLDS 1.0318的生长有一定抑制作用,但作用4 h后,菌株在胆盐质量浓度分别为0.3、0.5 g/100 mL的培养基中的存活率分别为95.40%和87.76%,活菌数对数值均在6以上。表明了植物乳杆菌KLDS 1.0318具有较好的胆盐耐受性。

图4 植物乳杆菌KLDS 1.0318对胆盐的耐受性

2.5 植物乳杆菌KLDS 1.0318对脾淋巴细胞增殖的影响

2.5.1 植物乳杆菌KLDS 1.0318对小鼠脾淋巴细胞转化值的影响 由图5可知,与阳性对照组相比,在乳杆菌与脾淋巴细胞的比例为1∶1、10∶1及100∶1三个条件下,脾淋巴细胞的转化值均有不同程度的提高,且差异显著(p<0.05),表明了植物乳杆菌KLDS 1.0318对体外小鼠脾淋巴细胞的转化有促进作用,并呈现剂量依赖关系。

图5 植物乳杆菌KLDS 1.0318对小鼠脾淋巴细胞转化值的影响

2.5.2 植物乳杆菌KLDS 1.0318对小鼠脾淋巴细胞增殖指数的影响 由图6可知,当乳杆菌与脾淋巴细胞的比例为1∶1时,淋巴细胞PI值小于1,当乳杆菌与脾淋巴细胞的比例为10∶1和100∶1时,PI值均大于1,表明了在此条件下植物乳杆菌KLDS 1.0318能够促进体外小鼠脾淋巴细胞的增殖,并表现出剂量依赖关系。

图6 植物乳杆菌KLDS 1.0318对小鼠脾淋巴细胞增殖指数(PI)的影响

2.6 植物乳杆菌KLDS 1.0318对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红能力的影响

由图7可知,与阴性对照组相比,在乳杆菌与巨噬细胞的比例为1∶1、10∶1及100∶1三个条件下,OD540均有不同程度的增长,说明在乳杆菌作用下,小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红能力显著增强(p<0.05),表明了植物乳杆菌KLDS 1.0318能够激活巨噬细胞活性,增强其吞噬功能。

图7 植物乳杆菌KLDS 1.0318对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红能力的影响

2.7 植物乳杆菌KLDS 1.0318对小鼠腹腔巨噬细胞能量代谢水平的影响

由图8可知,相比于阴性对照组,在乳杆菌与巨噬细胞的比例为1∶1、10∶1及100∶1三个条件下,OD450均有所增加,说明巨噬细胞在乳杆菌作用下,其能量代谢水平显著提高(p<0.05),表明了植物乳杆菌KLDS 1.0318能够增强巨噬细胞活性,提高其能量代谢水平。

图8 植物乳杆菌KLDS 1.0318对小鼠腹腔巨噬细胞能量代谢水平的影响

3 讨论与结论

乳酸菌是人和动物肠道中重要的生理菌群之一,具有促进机体对营养物质的消化和吸收、提高机体免疫力、降胆固醇、抑制有害细菌的生长、调节肠道菌群平衡等多种益生功能[23-26]。而乳酸菌在人体内发挥益生作用的前提是其可在人体肠道中存活并定殖。

乳酸菌能够快速生长以及发酵糖类产酸不仅是表明其活力良好的特征之一,还能够提高其发酵产品的稳定性和安全性[27-28]。本实验测定了植物乳杆菌KLDS 1.0318的生长曲线和产酸能力,结果表明该菌株生长迅速的同时具有较强的产酸能力,可初步作为具有潜在发酵性能的菌株。

pH是影响乳酸菌生长的重要因素之一,人体胃液里含有胃酸,其pH高低因个人饮食状况存在较大波动,空腹时pH为2.5左右,进食后胃液被稀释,其pH上升至3.5[29]。人体消化过程约需要4 h,而食物通过胃的时间一般为1～2 h[30],因此乳酸菌必须具有较强的耐酸能力才能顺利通过胃酸屏障而到达肠道中发挥其益生功能。Bezkorovainy等[31]通过体外研究发现,6株乳杆菌在pH1.5～3.0条件下的存活时间在3 h左右。本实验研究了植物乳杆菌KLDS 1.0318在3种不同酸度条件下短时间内的存活状况,结果显示,其在pH为2.5、3.5条件下培养至3 h后其存活率分别为95.40%和87.76%,表明植物乳杆菌KLDS 1.0318对酸具有较强的耐受能力。

食物中的乳酸菌经过胃的消化后进入小肠将会面临高浓度的胆盐环境,高浓度胆盐会破坏细胞膜正常结构,导致膜蛋白解离,使细胞内容物渗漏而造成细胞死亡[32]。因此,除了耐酸能力,乳酸菌能否适应人体小肠中的胆盐胁迫是其发挥益生功效的重要前提。人体小肠中的胆盐质量浓度在0.03～0.3 g/100 mL之间[33],食物在小肠中一般停留1～4 h[34],因此本实验研究了植物乳杆菌KLDS 1.0318在胆盐质量浓度分别为0.03、0.3和0.5 g/100 mL的培养基中培养0～4 h后,测定其活菌数的变化情况。结果显示,该菌株在胆盐质量浓度分别为0.3、0.5 g/100 mL条件下的存活率分别达到95.40%和87.76%,表明了植物乳杆菌KLDS 1.0318具有较好的胆盐耐受性。

本实验研究结果表明,植物乳杆菌KLDS 1.0318有较强的耐酸耐胆盐能力,具有在人体胃肠道中定殖的潜力。在此基础上,本研究测定了该菌株对小鼠体外免疫细胞活性的影响,评价其免疫调节功能。脾脏是机体最大的免疫器官,脾脏中的淋巴细胞是机体最重要的免疫细胞[19],淋巴细胞的转化值和增殖指数的大小可以直接反映其活力的高低,是反映T淋巴细胞免疫活力的关键指标之一[35]。孟祥晨等[36]通过体外研究发现植物乳杆菌KLDS 1.0391和植物乳杆菌KLDS 1.0706均对小鼠脾细胞有促进增殖作用。本实验研究发现,当乳杆菌与脾淋巴细胞的比例为1∶1、10∶1及100∶1时,相比于阳性对照组,脾淋巴细胞转化值均显著提高(p<0.05)。当乳杆菌与脾淋巴细胞的比例为10∶1和100∶1时,植物乳杆菌KLDS 1.0318能够显著提高脾细胞的增殖指数(PI值>1)。巨噬细胞也是机体重要的免疫细胞,具有强大的吞噬抗原颗粒的作用,还可作为抗原提呈细胞(antigen presenting cell,APC),调节和提高免疫应答。刘东方[37]通过体外研究表明,鼠李糖乳杆菌LV108和短双歧杆菌XJH301可以显著诱导巨噬细胞增殖,提高巨噬细胞吞噬活力。本实验研究结果表明,在乳杆菌与巨噬细胞的比例为1∶1、10∶1及100∶1三个条件下,相比于阴性对照组,植物乳杆菌KLDS 1.0318均能够显著提高巨噬细胞吞噬能力及其能量代谢水平。

综上所述,植物乳杆菌KLDS 1.0318生长较快,具有较强的产酸、耐酸及耐胆盐能力,能够促进脾淋巴细胞和巨噬细胞的免疫活性,可以作为具有潜在免疫调节作用的益生乳杆菌。