谷氨酰胺转运蛋白SLC1A5在胶质瘤中的表达及其临床病理学意义

房信博 冯茜 张旭光 王琳娜

神经胶质瘤又称为胶质瘤，占颅脑肿瘤的40%～50%，具有生长迅速，侵袭能力强及易复发等特点，是最常见的颅内恶性肿瘤。尽管目前胶质瘤的临床治疗已有很大提高，但是其预后依然很差。胶质瘤的发病原因尚不清楚。但快速增生，发展迅速是胶质瘤细胞最突出特征。快速增生的胶质瘤细胞必须调整自身代谢，进行代谢重编程[1]，从而尽可能的获得养分来满足其快速增生所需。葡萄糖无氧糖酵解被认为是肿瘤细胞的重要能量代谢功能方式之一，但近来研究发现，谷氨酰胺也是肿瘤细胞赖以生存的重要营养物质[2-3]。肿瘤细胞在内外因素驱动下发生谷氨酰胺代谢重编程，可从细胞外摄取谷氨酰胺，为生物大分子合成提供碳源，维持氧化还原平衡，调控增生等相关活动，从而促进肿瘤的发生发展[4]。由此可见葡萄糖和谷氨酰胺均可作为肿瘤细胞赖以生存的主要原料，阻断任何一个代谢途径都有助于肿瘤的治疗[5]。SLC1A5是肿瘤细胞摄取细胞外谷氨酰胺重要的膜转运蛋白[6]，在肿瘤细胞谷氨酰胺代谢中起着重要的作用[7]；但SLC1A5在胶质瘤中鲜有研究报道[8]。在本研究中，为明确SLC1A5在胶质瘤中表达的临床病理学意义及体外细胞系所介导的生物学作用，我们分别运用免疫组化和RNA干扰技术分析SLC1A5的表达及在胶质瘤细胞增生、浸润中的作用，以期为靶向干预SLC1A5治疗胶质瘤提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 临床组织标本 本研究通过了淄博市中心医院医学伦理审查委员会的批准，手术样本获得均具有患者的知情同意书。收集了2014-01-01—2018-01-01在淄博市中心医院神经外科进行手术治疗的70例神经胶质瘤患者的临床组织标本置于液氮中冻存待用。70例胶质瘤标本中，星形胶质瘤24例，少突星形胶质瘤23例，少突胶质瘤23例；发生转移的22例，未转移48例；女34例，男36例；Ⅰ级8例，Ⅱ级22例，Ⅲ级28例，Ⅳ级12例；直径小于3 cm的52例，大于3 cm的18例。所有70例患者均有预后随访信息，并且所有胶质瘤标本HE切片均经过临床病理医师核片且确认。

1.2 细胞培养 人神经胶质瘤细胞系U87细胞购自上海生命科学研究院细胞库，在含有青霉素(100 IU/mL)和链霉素双抗(100 IU/mL)，10%胎牛血清的RPMI1640培养基中培养置于5%CO2培养箱中常规培养。

1.3 主要抗体和试剂 兔抗人SLC1A5单克隆抗体购自武汉华美公司 (货号：CSB-PA620892DSR1HU，按1∶5 000稀释)、PV-9000试剂盒和DAB显色试剂盒均为北京中杉金桥生物技术公司产品。SLC1A5慢病毒载体构建包装等均有上海吉凯公司外包完成。

1.4 免疫组织化学 免疫组织化学Envision二步法操作步骤参照试剂盒说明书进行。胶质瘤组织切片经过常规脱蜡，抗原采用0.01 mol/L的枸橼酸钠缓冲液微波加热修复。以正常兔的IgG取代一抗作为空白对照，用已知的乳腺癌组织作为阳性对照组织。SLC1A5阳性主要定位细胞膜，少部分细胞膜细胞质兼呈现黄褐色或棕褐色颗粒。在低倍镜(×100)下观察整张切片，随机选择4个高倍视野(×400)计数阳性细胞，将胶质瘤患者按SLC1A5表达强度分为高表达组(阳性着色强度＋＋和＋＋＋)和低表达组(－和＋)。

1.5 Western blot 收集U87胶质瘤细胞，加入RIPA裂解液置冰上裂解30 min，BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，调整蛋白上样量为30 μg/孔，电泳，转膜，脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗(SLC1A5)4℃摇床孵育过夜。TBST洗膜，荧光二抗孵育2 h，LI-COR系统(LI-COR，Odyssey)扫膜并定量分析条带灰度值。

1.6 细胞增生实验(MTT) U87胶质瘤细胞接种于96孔板中，每组设4个复孔，分别于接种后0、24、48、72和96 h，加入5 mg/mL的MTT溶液，置于细胞培养箱中孵育4 h，弃上清，加入150 μL的二甲基亚砜(DMSO)，充分震荡混匀后用酶标仪检测490 nm处的吸光度值。

1.7 细胞侵袭实验(Transwell) 配制基质胶，将配好的基质胶加入到Transwell小室上室，细胞培养箱中放置过夜使其充分干燥。Transwell小室下室加入500 μL含10%FBS的RPMI1640培养基，细胞用无血清培养基混匀后加入上室，置于恒温细胞培养箱培养48 h后，用棉签轻轻擦去上室内未迁移的细胞和基质胶，4%多聚甲醛固定，PBS清洗，结晶紫染色30 min后再用磷酸盐缓冲液清洗。显微镜下观察，随机选取4个视野，计数每个视野下染色细胞数量，取平均值。

1.8 统计学方法 采用SPSS 19.0软件分析，计量资料采用(±s)表示，符合正态分布的，采用独立样本t检验；SLC1A5表达水平与临床病理参数的相关性分析采用卡方检验；单因素生存率分析用Kaplan-Meier检验；以检验水准P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

相比较正常脑组织，SLC1A5在胶质瘤中显著性上调表达。为明确SLC1A5在胶质瘤中的表达水平，我们运用免疫组化检测了SLC1A5的表达。SLC1A5主要定位于细胞膜，部分病例组织细胞膜和细胞浆兼而有之。SLC1A5在胶质瘤中呈异质性表达，其表达强度从阴性表达，弱阳性，中阳性和强阳性表达均有。但在正常脑组织中，绝大部分正常组织中检测不到SLC1A5的表达，只有少部分呈弱阳性表达。正常脑组织中的神经胶质细胞，神经元细胞，内皮细胞和嗜中性粒细胞等均为SLC1A5阴性表达；相比之下，SLC1A5在胶质瘤细胞中显著性上调表达(图1)。

图1 免疫组化检测SLC1A5在胶质瘤中的表达水平

SLC1A5上调表达与患者不良预后及肿瘤大小具有统计学相关性。为明确SLC1A5表达的临床病理学意义，我们运用卡方检验及Fisher精确检验法分析了SLC1A5表达水平与胶质瘤患者的临床病理学参数，包括胶质瘤大小(cm)，WHO分级，性别，肿瘤转移，病理亚型(星形胶质瘤，少突星形胶质瘤及少突胶质瘤)和总预后的统计学相关性。我们发现SLC1A5高表达与胶质瘤患者的不良预后具有统计学相关性(图2)，提示SLC1A5的表达水平或可作为胶质瘤患者不良预后的一个潜在预测标志物。

图2 Kaplan-Meier预后生存曲线分析SLC1A5的表达水平与胶质瘤患者的总预后之间的统计学相关性。n表示例数，运用Log-rank统计分析。

此外，SLC1A5上调表达还与胶质瘤大小，病理分级及肿瘤转移具有统计学相关性，与其他临床病理学参数不相关(表1)。

表1 SLC1A5在胶质瘤中表达的临床病理学意义分析(n)

沉默SLC1A5能够显著性抑制胶质瘤细胞系U87的增生和浸润。为进一步探讨SLC1A5在胶质瘤细胞增生和浸润中所介导的生物学作用，我们构建了SLC1A5特异性短发夹RNA干扰(shRNA)慢病毒载体。体外转染U87细胞系后，运用western-blot技术检测沉默效果，发现我们构建的慢病毒载体能够有效地沉默SLC1A5蛋白的表达(图3A)。之后，我们运用MTT实验检测了沉默SLC1A5相比对照组的细胞增生变化情况(图3B)，发现沉默SLC1A5能够显著性抑制胶质瘤细胞U87的增生。进一步我们运用Transwell实验评价了沉默SLC1A5后细胞浸润能力的变化(图3C)，发现沉默SLC1A5能够显著性抑制胶质瘤细胞U87的浸润能力，提示SLC1A5在胶质瘤细胞的增生和浸润中起着重要作用。

图3 沉默U87细胞的SLC1A5能够显著性抑制其增生和浸润

3 讨论

研究发现除了葡萄糖以外，谷氨酰胺是胶质瘤细胞为适应自身快速生长进行能量重编程[1，9]所需要的一种重要能源物质[3，10]。因此，靶向胶质瘤细胞的能量代谢，通过阻断胶质瘤细胞代谢途径，通过“饿死”胶质瘤细胞可能是一种潜在的新的临床治疗策略[11]。而SLC1A5是定位于细胞膜上的谷氨酰胺转运蛋白，在肿瘤细胞摄取细胞外源性谷氨酰胺中起着重要作用。鉴于此，我们选择谷氨酰胺转运蛋白SLC1A5作为本研究对象。我们为靶向SLC1A5阻断胶质瘤细胞以谷氨酰胺为能量替代物质作为能量代谢提供重要的理论依据，因而具有重要的意义。

鉴于SLC1A5在肿瘤谷氨酰胺代谢中的重要性，SLC1A5在恶性肿瘤中已有较多研究报道。但在胶质瘤中研究不多见[8，12-13]。目前有关SLC1A5在胶质瘤中的研究多为体外细胞培养机制研究，在体内临床组织水平目前尚未见研究报道。因此，为探讨SLC1A5在胶质瘤中表达的临床病理学意义及在体外胶质瘤细胞增生浸润中所介导的生物学作用，我们运用免疫组化技术在70例临床胶质瘤组织标本中检测了SLC1A5的表达水平并分析了其表达的临床病理学意义。我们发现相比正常脑组织，SLC1A5在胶质瘤组织中呈显著性上调表达。其上调的SLC1A5与胶质瘤患者的肿瘤大小、转移及不良预后均有统计学相关性。我们的研究结果与Bjersand K等在卵巢癌[14]、Toyoda M等在舌癌[15]中的研究报道相一致，提示SLC1A5可能是恶性肿瘤患者不良预后的一个潜在预测标志物。在本研究中，我们只运用了单因素Kaplan-Meier生存分析，并未探讨SLC1A5的表达在胶质瘤中能否作为一个独立的预后相关因素。因此我们的研究与Liu Y等在肾透明细胞癌[16]中的研究结论不一致。Liu Y等发现SLC1A5的高表达是肾透明细胞癌患者的一个独立预后因素。在体外胶质瘤细胞系中，我们发现沉默SLC1A5能够显著性抑制U87细胞的增生和浸润，这与国内学者Cai C等[17]在结直肠癌中的研究发现是一致的，即干扰SLC1A5能够显著性抑制结直肠癌的增生和浸润。尽管如此，SLC1A5的作用机制依然未知[18]仍待于进一步探讨。本研究有以下几点局限性值得注意：首先，本研究所纳入的样本例数有限，因此有待于进一步扩大样本进行多中心验证；其次，本研究只运用了一种胶质瘤细胞系，因此在体外细胞系水平仍有待于进一步验证。