山楂叶总黄酮对非酒精性脂肪性肝病细胞病理及血脂影响的实验研究*

黎运呈 王 艳 王秋景 盛国光 高 莉△

1.浙江省舟山医院感染科 (浙江 舟山， 316004) 2.湖北省中医院

随着目前饮食习惯的改变，脂肪肝的发病率逐年升高，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除外酒精和其他明确的损肝因素所致的，以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变为主要特征的临床病理综合征，包括单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎(NASH)和肝硬化等一系列变化[1～3]。肝脏是机体脂质代谢的中心器官,也是内源性和外源性脂肪代谢的交汇点和调节中枢,肝细胞内甘油三酯的沉积是形成NAFLD的先决条件。山楂叶总黄酮(HLF)是从蔷薇科植物山楂的干燥叶中提取的黄酮类化合物，现代药理学研究表明，山楂叶总黄酮具有降低血脂、抗氧化、降糖、抗血小板聚集等作用[4]。本实验通过观察山楂叶总黄酮对NAFLD细胞模型病理及血脂的影响，探讨其作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验用药物与细胞系 山楂叶总黄酮(HLF)(长春三九生物制药，批号:20140823)；水飞蓟素胶囊(商品名:利加隆，批号:20140112，德国马博士大药厂生产)。人正常肝细胞L-02株，购自中科院上海细胞研究所细胞库。

1.2 化学药品与试剂 胎牛血清(FBS)购自杭州四季青公司;油酸(OA)购自天津风船化学试剂科技有限公司;软脂酸(PA)、油红O、二甲基亚砜(DMSO)、SDS-PAGE试剂、RNA酶购自美国Sigma公司;达氏修正依氏培养基(DMEM)和小牛血清(FCS)购于Gibco公司;甘油三酯(TG)试剂盒、超微量Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶测试盒、考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒均购自南京建成生物工程公司;溴化二甲噻唑二苯四氮唑(MTT)购于罗氏公司。

1.3 实验仪器 全自动酶标仪，Powerwave X340，美国Bio-Tek公司；图像获取系统，Olympus DP71；CO2恒温培养箱，美国Thermo；倒置显微镜，日本Olympus；超低温冰箱，MDF-382ECM；超净工作台，苏州净化设备有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养 人正常肝L-02细胞用含有10%胎牛血清的DMEM培养液,于37℃、含5%CO2的温箱中培养72h,细胞70%～80% 融合时,以0.25%胰酶/0.02% EDTA消化传代,更换培养液。

1.4.2 建立NAFLD细胞模型 上述培养细胞换液时，换成含有1mmol/L 游离脂肪酸(FFA)混合物(OA∶PA= 2∶1)的10%胎牛血清的MEM培养液,诱导24h、48h、72h,收集细胞,分别进行油红O染色、显微镜观察、计算细胞活力和TG测定等，细胞模型。

1.4.3 NAFLD细胞分组 实验分为正常组、模型组、水飞蓟素组和山楂叶总黄酮(HLF)组共4组，每组分4个培养瓶，正常组用MEM培养液换液,而模型组、水飞蓟组和HLF组换液时换成含有1mmol/L FFA混合物(OA∶PA= 2∶1)的10%胎牛血清的MEM培养液诱导，其中水飞蓟素组加入150μg/ml的水飞蓟干预，HLF组加入400μg/ml的HLF干预。实验重复5次。

1.4.4 MTT检测抑制率 取对数生长期的细胞(1×105个/孔)种植于96孔培养板24h孵育后，各治疗组药物作用L-02细胞共48h，取出培养板，每孔加入5mg/ml的MTT 10μl，混匀，继续培养4h，弃去上清液，每孔加入100 μl DMSO，震荡10min使结晶充分溶解，酶标仪在波长490nm条件下测每孔吸光度。实验重复5次。

1.4.5 电镜检测 各治疗组药物作用L-02细胞共48h，收集细胞，PBS清洗细胞2次，加2.5%戊二醛固定24h，送浙江大学测试中心电镜室进行透射电镜标本的制备及观察。

1.4.6 观察指标检测 观察根据试剂盒提供方法检测甘油三酯(TG)、Na+-K+-ATP酶及超微量Ca2+-Mg2+-ATP酶的活力。

2 结果

2.1 HLF对NAFLD细胞生长的影响 NAFLD细胞培养48 h测各组OD值，各组间比较，模型组内细胞的生长抑制率最高，与HLF组比较有极显著性差异(P<0.01)，提示模型组内细胞生长明显受抑制，药物干预后，细胞生长抑制状况能有不同程度缓解。见表1。

表1 HLF对NAFLD细胞抑制率的影响

2.2 电镜检测结果 正常组肝细胞结构清晰，细胞器结构完整，肝细胞线粒体丰富，形态正常，膜与嵴连续完整，嵴排列整齐，基粒完整；未见明显异常病变。模型组肝细胞内线粒体体积增大，明显水肿，嵴断裂，甚至消失，基粒脱落，基质内可见多个亮区，外膜有破裂现象，线粒体混浊肿胀明显；细胞核的形状不规则，呈锯齿形，出现核固缩碎裂现象，细胞呈凋亡特征性改变。HLF组肝细胞内各细胞器可见，核内染色质均匀，核周间隙清晰，部分线粒体肿胀，线粒体嵴可见，排列紊乱，膜完整，可见线粒体增生分裂现象。水飞蓟素组内肝细胞可见各细胞器，细胞核异染色质增多，线粒体肿胀明显，线粒体嵴紊乱、消失，基粒脱落，可见亮区；线粒体可见膜边缘模糊，部分膜破裂，线粒体受损。见插页彩图1。

2.3 各组细胞TG含量的变化 在6h、12h、24h、48h各时间点，各组细胞TG含量的比较，均有极显著性差异(见表2)。

表2 各组细胞TG结果比较

2.4 各组细胞超微量Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的变化 在6h、12h、24h、48h各时间点，Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性各组间比较，均有极显著性差异(见表3、表4)。

表3 各组细胞Na+-K+-ATP酶活性结果比较

表4 各组细胞Ca2+-Mg2+-ATP酶活性结果比较

3 讨论

NAFLD是由于肝脏内堆积的脂肪过多，造成肝脏脂肪变性。NAFLD患者通常伴有肝细胞损伤和肝脏炎症，称为NASH。NAFLD和NASH已成为西方国家头号肝病，其发病率在20年内增加了1倍。当疾病进展为NASH时患肝硬化、肝功能衰竭和肝癌的风险增加，且NASH引起的肝硬化和因肝病死亡的发生率在近10年分别在20%和12%以上，因此，研究NAFLD的机制及防治药物，阻止或延缓其发生发展意义重大[5,6]。因NAFLD/NASH的确切病因尚未取得统一意见，目前西医对于NAFLD/NASH缺乏有效的治疗方法，而中医药根据脂肪肝以湿热内蕴、脾虚湿痰、痰瘀互结为基本证型的特点，采用祛湿化痰，活血等治法能明显改善脂肪肝的临床症状及肝功能、血脂、血糖等多项指标，改善肝脏微循环，促进受损肝细胞的恢复。中医药在治疗过程中无明显不良反应，因而成为治疗脂肪病肝性的特色和优势[7、8]。

山楂叶为蔷薇科植物山里红或山楂的干燥叶，有活血化瘀、化浊降脂等功能，现代药理学研究表明山楂叶总黄酮(HLF)具有抗动脉粥样硬化、降血脂、抗氧化应激、抗血小板凝聚、抗细胞凋亡等作用[9、11]。本实验结果显示，模型组内肝细胞的生长受到抑制，通过HLF干预后，肝细胞生长抑制状况有不同程度的缓解，与模型组比较有显著性差异。可见，肝细胞在脂肪酸的持续刺激作用下生长受到抑制，山楂叶总黄酮能有效缓解NAFLD所致的肝细胞生长抑制，随着浓度增加，缓解生长抑制的效果明显。模型组中TG在各个时间点均持续升高，在HLF的作用下，TG明显下降，与模型组比较有极显著性差异。超微量Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶属于ATP 酶系统，ATPase是一类与细胞功能密切相关的化学酶，在能量的转换，离子的运输及信号传递等方面发挥着巨大的作用[12]。Na+-K+-ATP和Ca2+-Mg2+-ATP存在于细胞膜上， 有离子载体的作用，能起到调节细胞膜两侧的电位平衡、组织渗透压，为细胞各种功能活动提供能量，本实验研究发现，HLF组中Na+-K+-ATP在48h时间点上活性最高，与模型组及水飞蓟素组比较有极显著性差异(P<0.01)，HLF组中Ca2+-Mg2+-ATP在各个时间点上的活性，与模型组比较均有极显著性差异(P<0.01)，由实验结果可知，HLF能降低NAFLD对细胞生长的抑制率，降低TG，提高Na+-K+-ATP和Ca2+-Mg2+-ATP的活性。

线粒体是肝细胞最重要的细胞器之一，提供了细胞所需的90%以上能量。肝细胞的脂肪变与线粒体氧化功能的改变密切相关，线粒体的脂肪酸β氧化受损在肝脏脂肪变的过程中起主要作用，凡是干扰了线粒体功能和脂肪酸代谢的因素，都将导致肝脏脂肪变[13～15]。从超微病理图片分析，模型组肝细胞内线粒体体积增大混浊肿胀明显，嵴断裂，甚至消失，基粒脱落，基质内可见多个亮区，外膜有破裂现象，细胞核锯齿形改变，有核固缩现象；药物治疗组肝细胞内细胞器可见，线粒体部分肿胀，线粒体嵴可见，膜完整，与模型组比较，线粒体形态变化明显得到改善。实验结果表明，山楂叶总黄酮对肝细胞的能量发生器—线粒体能起到保护作用。我们推测山楂叶总黄酮保护肝细胞线粒体的这一特点可能是通过其降脂、抗凋亡、提高细胞关键酶的活性等综合作用而达到的。山楂叶总黄酮能有效改善肝细胞细胞器的形态，降低血脂，维护肝细胞的功能，进而干预脂肪肝的发展进程。