基于网络药理学探讨左归丸“补肾生髓成肝”的疗效机制*

高翔 叶之华 戴玲 李瀚旻△

1.湖北省中医院肝病研究所 (湖北 武汉， 430061) 2.湖北省中医药研究院中医基础理论研究所 3.湖北中医药大学2016级博士研究生班

左归丸是明代医家张仲景的补肾名方，临床应用广泛[1]，我们前期研究发现左归丸能够促进骨髓干细胞转化肝细胞，参与肝组织再生修复，并对其分子作用机制开展了一系列实验研究[2～4]。本研究运用网络药理学方法，从系统生物学角度探讨左归丸复方制剂中的药效活性成分多靶点、多层次协同作用调控肝再生的作用机制，阐释“补肾生髓成肝”治疗法则的生物学基础。

1 资料与方法

1.1 研究策略 检索中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP)[5]和中药分子机制生物信息学分析工具(BATMAN-TCM)[6]筛选左归丸的药效活性成分和潜在作用靶点，利用生物学信息注释数据库(DAVID)和KEGG通路数据库(KEGG PATHWAY Database)分析靶点基因功能分类及其涉及的信号通路。利用蛋白质相互作用数据库(STRING Database)构建靶点基因编码蛋白质的相互作用网络模型。

1.2 药效活性成分—靶点预测 利用TCMSP(http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php)和BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)搜索熟地黄、山茱萸、山药、菟丝子、川牛膝、枸杞子、龟板胶、鹿角胶的有效成分，筛选出口服利用度(OB)≥30%且似药性(DL)≥0.18的药效活性成分并预测其潜在作用靶点，利用UniProt蛋白质数据库(http://www.uniprot.org/)和HGNC人类基因名数据库(https://www.genenames.org/)将潜在靶点转换为标准名称(gene symbol)和检索号(Ensemble Gene ID)。

1.3 靶点通路注释分析 将潜在作用靶点的Ensemble Gene ID上传至DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)进行基因功能注释(GO)富集分析和KEGG信号通路(KEGG pathway)富集分析，P<0.05为分析具有统计学意义。

1.4 靶点相互作用网络模型构建 利用STRING数据库(https://string-db.org)构建靶点基因编码蛋白质的相互作用网络模型，通过文本挖掘、实验证据和数据库挖掘并限定相互作用评分≥0.900筛选靶点基因编码蛋白质之间的相互作用关系，筛选相互作用评分≥0.995的关键靶点，并采用K均值聚类方法进行聚类分析。

2 结果

2.1 左归丸药效活性成分—靶点的预测 通过检索TCMSP和BATMAN-TCM数据库，筛选出槲皮黄酮、海风藤酮、异鼠李素、谷甾醇类、山柰酚、豆甾醇、薯蓣皂苷元、亚麻酸乙酯、芝麻素、荜茇宁酰胺、油酸乙酯、环阿屯醇、颠茄碱、山蒟酮、异岩藻酯醇等65个药效活性成分，AKT1、BAX、BCL2、FOS、CDK2、EGF、GSK3B、IKBKB等靶点基因351个。

2.2 靶点基因功能注释分析 以P<0.05且靶点数≥20为筛选原则，靶点基因主要涉及药物反应、乙醇应答、凋亡过程及正负调控、细胞增殖及正负调控等28种生物学过程(见表1)，酶结合、药物结合等15种分子功能(见表2)，以及质膜、电压门控钾离子通道复合体等26种细胞组分(见表3)。

表1 左归丸药效成分靶点基因功能(生物学过程)聚类结果

表2 左归丸药效成分靶点基因功能(分子功能)聚类结果

表3 左归丸药效成分靶点基因功能(细胞组分)聚类结果

2.3 靶点基因-信号通路富集分析 靶点基因涉及144条信号通路，以P<0.05且靶点数≥20为筛选原则，靶点基因主要富集于癌症相关通路、乙型肝炎、前列腺癌、HIF-1信号通路、TNF信号通路等32条信号通路见表4。

表4 左归丸药效成分靶点基因信号通路富集分析结果

2.4 关键靶点相互作用网络模型 左归丸药效成分靶点基因信号通路富集前5条通路包括81个靶点基因，通过文本挖掘、实验证据和数据库挖掘并限定相互作用评分≥0.900，靶点之间相互作用关系共计472条，PPI富集分析P<1.0×10-16，提示这群靶点基因编码的蛋白质具有一定程度上的生物学相关性，其中相互作用评分≥0.995的关键靶点有45个，K均值聚类方法将其分为2类(见表5)，其相互作用网络见图1。

表5 左归丸药效成分—关键靶点蛋白K均值聚类分析结果

图1 左归丸药效成分—关键靶点蛋白相互作用网络模型

3 讨论

近年来，随着计算机技术在生命科学中的应用和系统生物学的发展，系统药理学这一新的研究领域进展迅速，它从药物小分子、DNA和蛋白质等生物大分子、信号通路等多层次、多维度研究药物与机体的相互作用方式，为理解中药复方中复杂成分综合发挥药效作用的药理机制提供了新的解决方案。国内多个研究团队开发了面向中药研究的系统药理学网络数据库、分析工具和平台，为从系统水平阐明中药复方作用机理、优化组方配伍等提供了新的研究方法。本研究中主要使用中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP)、中药分子机制生物信息学分析工具(BATMAN-TCM)进行中药复方药效活性成分筛选和潜在作用靶标预测。TCMSP整合了药物代谢动力学、药物化学和药物-靶标蛋白网络-疾病网络，包括2010版中药药典中的500味中药所包含的化合物30069个，并提供用于药物筛选和评价的药代动力学性质相关数据，如口服生物利用度(OB)、小肠上皮通透性、似药性(DL)、血脑屏障通透性、药物半衰期、溶解度、药物成药五原则等，本研究以OB≥30%且DL≥0.18为药效成分筛选标准。此外，该数据库通过模型预测和整合现有实验数据预测了药效活性成分的靶标蛋白信息。

左归丸出自《景岳全书》，滋阴补肾、填精益髓，主治真阴不足诸证。我们前期开展的体内外实验研究均发现左归丸能够促进骨髓干细胞转化肝细胞、参与肝组织再生修复，体现了“补肾生髓成肝”的治疗法则[7～9]。本研究运用网络药理学方法，从系统生物学角度探讨左归丸复方制剂中的药效活性成分多靶点、多层次协同作用调控肝再生的作用机制，阐释左归丸治疗肝脏病(肝病从肾论治)、发挥“补肾生髓成肝”治疗作用的生物学基础(疗效机制)[10～16]。通过TCMSP和BATMAN-TCM平台筛选出左归丸复方中槲皮黄酮、海风藤酮、异鼠李素、谷甾醇类、山柰酚、豆甾醇、薯蓣皂苷元、亚麻酸乙酯、芝麻素、荜茇宁酰胺、油酸乙酯、环阿屯醇、颠茄碱、山蒟酮、异岩藻酯醇等65个药效活性成分，圈定351个潜在作用靶标，包括AKT1、BAX、BCL2、FOS、CDK2、EGF、GSK3B、IKBKB等，主要涉及药物反应、乙醇应答、凋亡过程及正负调控、细胞增殖及正负调控等28种生物学过程，靶标基因主要富集于癌症相关通路、乙型肝炎、前列腺癌、HIF-1信号通路、TNF信号通路等32条信号通路，通过文本挖掘、实验证据、数据库挖掘和限定相互作用评分的方法筛选出45个关键靶点并构建靶点间相互作用网络模型。上述结果提示，左归丸治疗肝脏病、发挥“补肾生髓成肝”作用的疗效机制可能是其药效活性成分通过靶基因-信号通路网络调节药物、乙醇及病毒因素等引起的肝组织应答，动态调节肝组织细胞增殖/凋亡，多层次、多途径实现减轻肝脏组织损伤、优化肝脏再生修复。