水产品中喹诺酮类药物残留限量及检测技术研究进展

赵付文，刘志鸿，荣小军

(中国水产科学研究院黄海水产研究所，农业部海洋渔业可持续发展重点实验室, 山东 青岛 266071)

中国水产养殖业发展迅速已成长为水产品生产大国，仅2016年全国水产品产量6 900万t，比上年增长3.0%。其中，养殖水产品产量5 156万t，增长4.4%；捕捞水产品产量1 744万t，下降1.0%[1]。目前，中国允许使用的水产兽药中抗生素类药物有氨基糖苷类、四环素类、酰胺醇类、磺胺类和部分喹诺酮类药物。无节制、不合理规范的用药情况时有发生，使水产品药物残留问题日益突出。由此引发的食品安全危机受到了越来越广泛的关注。

喹诺酮类抗菌药是指人工合成的一类抗菌药物，这种类型的抗菌药物在临床上的应用已经有40多年的历史了。其主要有4代，第1代主要对大肠杆菌起作用；第2代主要对绿脓杆菌、沙雷杆菌等菌群的抗菌效果较好；第3代抗菌谱增加了葡萄球菌等革兰阳性菌和一些革兰阴性菌；第4代引入8-甲氧基加强了抗厌氧菌活性，此类药物的不良反应更小，但相对来说价格较贵。作为水产动物和鱼类细菌性疾病的克星，已被广泛应用于水产养殖动物细菌性疾病的治疗中，而其兽药残留问题亦已引起各国的极大关注[2]。中国以及欧盟、美国及日本等国家和地区都将喹诺酮类药物列入限制使用的兽药药物名单中, 并制订出相关的最高残留限量。用药安全已成为水产业发展亟待解决的主要矛盾，通过开展喹诺酮类药物的的毒性研究、残留限量及水产品中喹诺酮类药物残留的检测方法，以期能为合理、科学地使用该类药物，防止耐药性产生提供参考。

1 部分喹诺酮类药物残留限量

针对喹诺酮类药物残留危害，各国政府十分重视并及时对部分种类制定了残留限量标准，美国则明令禁止喹诺酮类抗菌药在水产养殖业中使用。2015年9月1日起，中国农业部公告第2292号，即“决定在食品动物中停止使用洛美沙星等4种兽药，撤销相关兽药产品批准文号”。喹诺酮类按发明先后及其抗菌性能的不同，分为1～4代。从分子结构上来看，第2代喹诺酮类药物增加了部分抗菌活性的基团；第3代喹诺酮类药物在C6位引入氟，C7引入碱性哌嗪基，使抗菌活性大大增加；第4代喹诺酮类在结构上引入8-甲氧基，C7位上的氮双氧环结构从而加强了抗厌氧菌活性。从药理作用上来看，前三代的喹诺酮作用于DNA回旋酶(拓扑异构酶Ⅱ)，干扰细菌细胞的DNA复制而呈现杀菌作用，第4代喹诺酮既作用于拓扑异构酶Ⅱ，也作用于拓扑异构酶Ⅳ，干扰细菌细胞的DNA复制，染色体受损从而产生杀菌作用。主要药物的名称、药理作用和在水产品中的最大残留限量(MRLs)详见表1。

表1汇总了16种喹诺酮类药物在水产品中的MRL和标准来源，其中第3代喹诺酮类药物在水产品中的应用最广泛，相关限量标准也较全面。各国在水产品中喹诺酮类最大残留限量不尽相同，中国农业部规定了第3代氧氟沙星、培氟沙星和洛美沙星在食品动物中禁止添加，美国规定了第3代氟罗沙星禁止检出，日本也限定了其中3种第3代喹诺酮类药物的限量。各国对第2代喹诺酮类药物的MRL绝大部分均都高于100 μg/kg，对第3代的MRL则低于此值。以第3代二氟沙星为例，中国农业部与欧盟标准对在水产脂肪的MRL规定相同(100 μg/kg)，表明中国对喹诺酮类药物在水产品中的MRL标准设定上与国际基本接轨。

表1 部分国家或地区规定的喹诺酮类水产品中最大残留限量(MRLs)Tab.1 The maximum residue limits(MRLs)of quinolone aquatic products in some countries or regions

续表1，Tab.1 Continued

2 喹诺酮类药物残留检测方法

各国政府对喹诺酮类残留检测的研究都非常重视，检测方法主要包括：高效液相色谱法(HPLC)、高效液相色谱/质谱联用法(HPLC-MS/MS)、毛细管区带电泳法等检测法等。

2.1 高效液相色谱法

HPLC具有分离能力强、灵敏度高和应用范围广的优点，该方法配合各种前处理技术手段，如基质固相分散萃取、固相萃取[3]和超临界流体萃取[4]等，采用高效色谱柱、高压泵和高灵敏度的检测器，柱前或柱后衍生化技术以及计算机联用等，大大提高了液相色谱的检测效率、灵敏度和分析速度。

朱品玲等[5]应用HPLC法建立了测定水产品肌肉中4种喹诺酮类残留量的方法，采用乙腈-二氯甲烷(4∶3，V/V)为提取液，浓缩至干，用20%乙腈水溶解残留物。HPLC条件：荧光检测器激发波长280 nm，流动相为0.010 mol/L四丁基溴化铵溶液(pH 3.0)-乙腈(95∶5，V/V)，4种物质的工作曲线线性范围0.05～1.00 μg/mL，水产品肌肉组织中检测限为3 μg/kg，测定低限为10 μg/kg，该方法适用于检测水产品体内的喹诺酮类残留。

表2列出了水产品中喹诺酮类残留高效液相色谱检测方法的应用情况，对喹诺酮同时分离种类、基质材料、提取溶剂、流动相、检出限和定量限进行了详细汇总。从表中看出线性范围大多在0.1～10.0 μg/mL，检测限多为10 μg/kg，HPLC法具有较好的分离度、灵敏度及准确度的特点，是目前应用最多的一种方法。但HPLC法检测时，由于方法和仪器自身的限制，检出限难以进一步降低，而且HPLC对于多种喹诺酮残留同时检测时效果一般，不适用于大量样品的快速分析和现场检测。另外，高效液相色谱方法存在溶剂消耗及环境污染较大、样品前处理复杂等弊端，成为制约高效液相色谱发展的瓶颈。

2.2 高效液相色谱/质谱联用法

HPLC-MS/MS具有同时分析多组分残留的检测，工作原理是样品中的被分析物经液相色谱柱分离后被输送到质谱，并依据特定的质荷比(m/z)离子进行选择，所选择的母离子产生具有特定结构信息的产物离子，从而对目标化合物进行选择性定量分析。它将色谱的高效分离能力和质谱的高灵敏度这两种优势结合在一起，可以对很多种类的化合物进行详细分析，HPLC-MS/MS技术已广泛应用于水产品中喹诺酮类物质的分析，如表3所示。

HPLC-MS/MS方法分析线性范围较广，特异性强，能准确地对微量兽药多种残留组分同时进行检测，且同时检测的生物数量明显多于HPLC方法。HPLC-MS/MS方法可以直接分析极性化合物、热不稳定性化合物、不挥发性化合物和大分子化合物，不需衍生化步骤。另外，HPLC方法无法准确地判断出样本的假阳性，HPLC-MS/MS方法同时能对兽药残留组分进行结构确证得到药物的分子结构信息，从而有效避免结果的假阳性。但HPLC-MS/MS分析方法前处理比较复杂，所需的仪器价格昂贵，极大地限制了方法的推广使用。

李佩佩等[14]建立了HPLC-MS/MS同时检测水产品中14种喹诺酮类药物的分析方法。进行基质固相分散净化后经液相色谱柱分离，以0.2%甲酸溶液和甲醇为流动相。14种喹诺酮类药物的线性范围0.50～20.0 μg/L，方法检出限为0.4～1.0 μg/kg，加标回收率为82%～90%。结合中国规定水产品中的喹诺酮类的MRLs，可以看出本方法完全满足水产品中14种喹诺酮类药物残留的快速确证和定量分析。

2.3 毛细管电泳法

毛细管电泳法操作简单、色谱柱不受缓冲液的各种表面活性剂等添加剂的酸碱性影响，具有分离效率高、运行成本低等优点，有利于实际样品的分析。Wang等[28]建立了测定喹诺酮药残的毛细管区电泳方法。水产样品在80 ℃和10.3 MPa下用乙腈作为溶剂进行加速溶剂萃取，使用大容量样品堆叠与极性转换的柱前预浓缩，测定4个喹诺酮类定量限为13.2～20 μg/kg。添加水平为50、100和500 μg/kg时，其平均回收率为85.4%～95.7%，对虾样本的相对标准偏差(RSD)分别为1.1%～4.7%，沙丁鱼的RSD为1.4%～4.5%。该方法快速简单，准确性和重现性令人满意。表4为毛细管电泳法在水产品中喹诺酮类残留检测中的应用情况。

表2 高效液相色谱法检测水产品中的喹诺酮类残留量Tab.2 Determination of quinolone residues in aquatic products by high performance liquid chromatography

表3 HPLC-MS/MS方法检测水产品中喹诺酮类的残留量Tab.3 Determination of quinolone residues in different aquatic products by HPLC-MS/MS method

续表3，Tab.3 Continued

表4 毛细管电泳法检测水产品中的喹诺酮类残留Tab.4 Determination of quinolone residues in aquatic products by capillary electrophoresis

3 结语

喹诺酮类抗菌药因其在水产动物和鱼类细菌性疾病的治疗效果较好，价格低廉，已被广泛应用于水产养殖动物细菌性疾病的治疗中，但因不规范用药造成的药物残留问题引起全世界关注。因此各国相继制定了相关MRL，中国农业农村部(原农业部)表现出了高度关注，在MRL设置方面与国际接轨。喹诺酮类药物残留检测的研究越来越受到重视，其中HPLC方法具有较好的分离度、灵敏度及准确度的特点，但对于多种喹诺酮残留同时检测时效果一般，前处理所需溶剂消耗量大，对环境污染严重；HPLC-MS/MS方法分析线性范围较广、特异性强及能准确地对微量兽药多种残留组分同时分析，农业部公告第1077号[32]水产品中15种喹诺酮类药物残留量的测定就是使用的本方法。但该设备价格昂贵，极大地限制了方法的推广使用；毛细管电泳法具有进样量小、分离度高、分析成本低的优点，但该法的缺点为检出限较高。可以根据实验所要研究的样品基质、对线性范围及检出限的要求选择使用合理准确的检测方法。