小菜蛾性信息素结合蛋白与顺-9-十四碳烯酸酯作用的分子模拟

赵奇 邓培渊 李玉华 杨玉珍 杨宗渠 雷志华

摘要：【目的】研究小菜蛾性信息结合蛋白（PxylPBP2）与顺-9-十四碳烯酸酯（Z9-14∶Ac）结合的分子动力学模式、结合内驱力及关键作用氨基酸，阐明二者识别的分子机制，为小菜蛾性诱剂的研发和小菜蛾防治提供参考依据。【方法】运用YASARA对PxylPBP2进行同源建模，运用AutoDock 4.2进行PxylPBP2与Z9-14∶Ac的空间结构对接，运用YASARA平台进行分子动力学模拟，运用MMPBSA.py模块计算PxylPBP2-Z9-14∶Ac复合物的结合自由能，以Amber 12软件包描述结合关键氨基酸，分析PxylPBP2與Z9-14∶Ac的结合模式及相互作用力。【结果】同源建模构建了合理的PxylPBP2空间模型，分子对接结果表明Z9-14∶Ac结合于PxylPBP2结合腔的内部，受体配体间无氢键，1.4 ns时对接复合物收敛平衡;PxylPBP2-Z9-14∶Ac结合自由能为-9.76 kcal/mol;Phe22和Ile104的贡献能量和占总结合自由能的43%。【结论】范德瓦斯力和非极性溶剂力是PxylPBP2与Z9-14∶Ac形成稳定复合物的主要内驱力，能量贡献最大的两个关键氨基酸（Phe22和Ile104）位于侧链上。

关键词： 小菜蛾;性信息素结合蛋白（PxylPBP2）;性信息素;分子动力学模拟;能量分解

中图分类号： S433.4                                  文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）11-2193-05

Molecular simulation of interactions between sex pheromone binding proteins and cis-9-tetradecenoic acid ester

in Plutella xylostella

ZHAO Qi1， DENG Pei-yuan2， LI Yu-hua1， YANG Yu-zhen1，YANG Zong-qu1， LEI Zhi-hua1

（1School of Life Science， Zhengzhou Normal University， Zhengzhou  450044， China; 2Key Laboratory of Biological Species Resource Research of Zhengzhou， Zhengzhou Normal University， Zhengzhou  450044， China）

Abstract：【Objective】Molecular dynamics model， internal promoting force and key amino acid of sex pheromone binding proteins（PxylPBP2） and cis-9-tetradecenoic acid ester（Z9-14∶Ac） in Plutella xylostella were studied to illustrate the molecular mechanism of their identification and provide reference for research and development of sex attractant for P. xylostella as well as the prevention and control of P. xylostella. 【Method】Some software was used to analyze the binding modes and interactions of PxylPBP2 and z9-14∶Ac， including homology modeling of PxylPBP2 with YASARA， the space structure docking of PxylPBP2 and Z9-14∶Ac with AutoDock 4.2， molecular dynamics simulation with YASARA platform， calculation of binding free energy of PxylPBP2-Z9-14∶Ac complex with MMPBSA. Py module， and description of binding key amino acids as well as analysis of binding mode and interaction force of PxylPBP2 and Z9-14∶Ac with Amber12 package. 【Result】The reasonable PxylPBP2 space model was constructed by homologous modeling. Molecular docking indicated that the binding of Z9-14∶Ac was in the interior of the PxylPBP2 binding chamber and there was no hydrogen bond between receptor ligands. Docking complex was convergent equilibrium at 1.4 ns. The binding free energy of PxylPBP2-Z9-14∶Ac was -9.76 kcal/mol. The contribution energy sum of Phe22 and Ile104 were 43% of the total binding free energy. 【Conclusion】Van der wals force and non-polar solvation are the principal inner drive to form stable complex between PxylPBP2 and Z9-14∶Ac， two key amino acids（Phe22 and Ile104） contribute the most largest amount of energy and they are located on the side chain.

Key words： Plutella xylostella;sex pheromone binding protein（PxylPBP2）;sex pheromone; molecular dynamics simulation; energy decomposition

0 引言

【研究意义】小菜蛾（Plutella xylostella）是危害十字花科蔬菜的重要鳞翅目菜蛾科害虫。由于长期使用化学农药防治小菜蛾，导致该害虫的抗药性提高（常晓丽等，2017）。采用性信息素进行小菜蛾生物防治因具有无害、高效的优点而被广泛采用（陈东旭等，2011）。因此，开展小菜蛾性信息素结合蛋白与性信息素的分子结合模式研究，可为新型性诱剂的研发、修饰和改造等提供重要参考。【前人研究进展】蛾类昆虫的性信息分子需通过一类小分子量蛋白的携带，才能从感器表皮运输到嗅觉受体神经元，这类小蛋白分子被命名为性信息素结合蛋白（Phe-romone binding proteins，PBPs）（李玉华等，2016）。即对PBPs在昆虫信息素传导过程分子机制的深入研究，可为理解昆虫信息素传递和信息素作用机理提供直接证据，同时为研发信息素类型的高效杀虫剂提供理论依据（Mitsuno et al.，2008）。Chisholm等（1983）研究发现小菜蛾性信息素的主要成分为顺-9-十四碳烯酸酯（Z9-14∶Ac）、顺-11-十六碳烯酸酯（Z11-16∶Ac）和顺-11-十六碳烯醛（Z11-16∶Ald）。孙梦婧（2013）从小菜蛾中鉴定出3个PBPs（PxylPBP1，PxylPBP2和PxylPBP3），荧光竞争结合试验证实PxylPBP2与Z9-14∶Ac特异结合，同时3种PBPs对性信息素类似物有较强的结合能力。李玉华等（2016）对PBPs与Z9-14∶Ac进行了初步对接研究，但缺少针对性信息素结合蛋白与性信息素成分相互作用分子机制的深入研究。【本研究切入点】与其他大多数分子对接研究相似，李玉华等（2016）研究了PxylPBP2与性信息素成分Z9-14∶Ac的初步对接，但在受体配体对接过程中受体的构象并不是固定不变，而会发生一些变化，因此本研究在对接基础上，进一步对PxylPBP2和Z9-14∶Ac进行分子动力学模拟，以弥补初步对接的不足，且更深入了解PxylPBP2与Z9-14∶Ac相互作用的过程和结合方式的细节。【拟解决的关键问题】以小菜蛾性信息素结合蛋白PxylPBP2和性信息素成分Z9-14∶AC为研究对象，在分子对接基础上，采用分子动力学、结合自由能计算、能量分解等方法，分析二者间的作用力类型、结合的关键位点和自由能，为阐明小菜蛾PBPs对Z9-14∶Ac的识别机制提供理论依据，同時为研发性信息素类似物、小菜蛾性诱剂及小菜蛾的防治提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 PxylPBP2三维模型和Z9-14∶Ac分子结构构建

从NCBI数据库中下载小菜娥PxylPBP2序列，登录号为AGH13203.1，在蛋白质晶体数据库（Protein DataBank，PDB）中搜索同源蛋白，将目标蛋白序列与模板蛋白序列比对，导入YASARA分子模拟平台进行同源建模，再进行去除H2O、加H和添加缺失原子的优化处理（Krieger et al.，2002）。

用ChemBioOffice中的ChemBioDraw模块构建Z9-14∶Ac的初始结构，用ChemBio3D进行立体空间结构构建和最小能量优化。

1. 2 分子对接

借助AutoDock 4.2进行PxylPBP2与Z9-14∶Ac空间结构对接，使用Autogrid程序进行网格计算。分子对接时，将Z9-14∶Ac设为全柔性结构，并设分子内的旋转键任意旋转，由AutoDockTools自动识别。通过局部能量搜索和拉马克遗传算法相结合的方法搜索对接构象，100次对接计算后，对结果进行聚类分析，借助Amber评分函数的打分保留对接能量最低的10个构象，选取最小结合自由能对应的构象进行分析。使用均方根偏差（RMSD）判断分子对接结果的可靠性和对接复合物的稳定性（刘吉元，2014）。

1. 3 分子动力学

借助YASARA分子模拟平台进行PxylPBP2-Z9-14∶Ac复合物的能量最小化和分子动力学模拟（Molecular Dynamics，MD）。首先，将PxylPBP2-Z9-14∶Ac溶解于立方体TIP3P显性H2O模型中，设为周期性边界条件，并设边界与溶质原子间的距离为7.00 ?，使用Amber12力场，通过添加抗衡离子（Na+和Cl-）保持体系电中性。设MD的模拟条件为：pH 7.4、300 K、NVT正则系宗，体系温度通过郎格万方法控制。动态模拟时长为20.0 ns，采用2.5 fs的积分步长，100 ps的采样间隔。

分子动力学模拟过程中的均方根涨落（RMSF）体现了分子对接复合物的柔性及其结构的局部运动特征，结合过程中柔性越强表明氨基酸数RMSF值越大（刘明，2010）。

1. 4 结合自由能计算

运用Amber12中的MMPBSA.py模块，采用分子力学泊松—玻尔兹曼表面积法（MM-PBSA）（Kollman et al.，2000）计算小菜蛾PxylPBP2-Z9-14∶Ac复合物的结合自由能，选取采样时间最后10.0 ns的100个构象进行分析。结合自由能公式如下：

ΔGbind=ΔGcomplex-ΔGreceptor-ΔGligand  （1）

ΔG=ΔEgas+ΔGsolve-TΔS        （2）

ΔEgas=ΔEele+ΔEvdw                         （3）

ΔGsolve=ΔGpb+ΔGnopolar                 （4）

其中，ΔGbind为结合自由能，ΔGcomplex为复合物的结合自由能，ΔGreceptor为受体结合自由能，ΔGligand为配体结合自由能，ΔEvdw为范德华力能，ΔEele为静电作用力能;溶剂化能（ΔGsolve）包括极性溶剂化贡献能（ΔGpb）和非极性溶剂化贡献能（ΔGnopolar）;ΔEgas表示气相内能，TΔS表示体系熵变值，本研究的目的是分析PxylPBP2-Z9-14∶Ac复合物关键氨基酸与能量贡献间的关系，故忽略熵变TΔS（Moreira et al.，2007）。

1. 5 能量分解

基于单个氨基酸能量分解的方法，利用Amber12软件包描述PxylPBP2和Z9-14∶Ac活性口袋关键氨基酸。氨基酸残基能量贡献通过公式换算为4个能量项。公式如下：

ΔG=ΔEele+ΔEvdw+ΔGpb+ΔGnopolar

2 结果与分析

2. 1 同源建模和模型准备

基于氨基酸序列和结构一致性的同源检索，找到与PxylPBP2相似性大于30%的3个模板，登录号分别为4INWA、1DQE和2WCJA，以此3个模板为基础进行同源建模。对生成的候选模板进行优化和精选，选择打分-0.054为最优模型，YASARA程序同源建模结果评价发现PxylPBP2中的氨基酸几乎均在最合适区域，说明PxylPBP2分子的三维模型十分合理，保存模型用于下一步的分子对接。对接配体Z9-14∶Ac结构进行能量最小化处理，保存备用。

2. 2 分子對接结果

PxylPBP2与Z9-14∶Ac设为刚性对接，用Grid Box包含分子结构，设126×126×126对接体系格点，采用0.0375 nm的间距，对接复合物和二者相互作用如图1所示。由图1-A可明显看出Z9-14∶Ac位于PxylPBP 2结合腔的内部;由图1-C可看出配体与受体间并未形成氢键。

2. 3 MD稳定性分析结果

通过软件分析出PxylPBP2-Z9-14∶Ac原子的RMSD（图2）和氨基酸残基RMSF（图3）。图2显示复合物在1.4 ns趋于收敛平衡，RMSD在2.10 ?左右波动，说明PxylPBP2-Z9-14∶Ac已达平衡，复合物具有较好的稳定性，表明分子对接结果可靠。

RMSF数据（图3）表明，复合物的RMSF平均值为0.134 nm（1.34 ?），其中氨基酸残基编号22和编号150左右的区域波动数值较大，表明该区域具有较强的柔性。数据波动较小的区域在氨基酸残基编号80和编号100左右的区域，具有非柔性特征，为相对保守区域。

2. 4 结合自由能分析结果

采用MM-PBSA计算PxylPBP2-Z9-14∶Ac结合自由能（Hou et al.，2011）。由表1可知，PxylPBP2-Z9-14∶Ac结合自由能为-9.76 kcal/mol，ΔG为负值，说明对接复合物会自发形成键合，图2对接复合物的RMSD变化曲线也显示复合物收敛平衡，波动幅度小，表明PxylPBP2-Z9-14∶Ac可形成稳定的复合物;PxylPBP2-Z9-14∶Ac结合自由能的标准方差SD=0.47（<0.50），表明结果可靠。范德瓦斯能量项（ΔEvdw=-42.56 kcal/mol）和非极性溶剂能量项（ΔGnopolar=-32.90 kcal/mol）为PxylPBP2-Z9-14∶Ac的结合提供了主要驱动力。极性溶剂化能量项为65.27 kcal/mol，非常不利于PxylPBP2-Z9-14∶Ac的结合，抑制力量高达ΔGpb=65.27 kcal/mol，静电作用能（ΔEele=0.42 kcal/mol）有微弱的抑制力量。自由能分项的标准方差均低于0.50，说明PxylPBP2-Z9-14∶Ac结合自由能的计算值完全可靠。

2. 5 单个氨基酸残基的能量分解结果

单个残基能量分项体现了单个残基对模拟体系中所有残基作用的总和，本研究借助Amber12程序分析单个氨基酸的总能量和侧链能量，结果见表2和图4。氨基酸能量贡献超过1.00 kcal/mol的有7个氨基酸，分别为Leu18、Phe22、Leu62、Leu71、 Ile104、Met124和Phe128，其中Phe22和Ile104的贡献能量均超过2.00 kcal/mol，二者能量之和占总结合自由能的43%。由图4可看出，侧链能量的分布与总能量基本保持一致，表明编号22、104和128氨基酸能量主要分布在侧链上，编号18、62、71和124氨基酸能量主要分布在主链上，即这些氨基酸的分布区域与RMSF的分析结果一致。

3 讨论

Sun等（2013）报道小菜蛾性信息素结合蛋白（PxylPBP2）与Z9-14∶Ac能特异性结合，与本研究结论一致，但其采用的荧光竞争结合试验只能定性判断二者的结合可能性，不能给出二者互相作用的分子机制。李玉华等（2016）采用分子对接研究了小菜蛾性信息素结合蛋白、性信息素、受体蛋白三者间相互作用的分子机制， 其研究重点是比较小菜蛾性信息素受体蛋白和性信息素结合蛋白对性信息素结合机制的差异，因此只是针对Z9-14∶Ac与性信息素受体蛋白和性信息素结合蛋白间的结合能力差异进行比较，且只进行静态对接研究和分析，同样缺少二者相互作用的分子机制。本研究在对接基础上从分子动力学角度更细致深入地揭示性信息素结合蛋白PxylPBP2与性信息素Z9-14∶Ac作用的分子机理，结果表明二者结合自由能为 -9.76 kcal/mol，复合物在1.4 ns时达2.10 ?的收敛平衡。此外，RMSF数据显示，编号22和编号150左右的区域柔性较大，且能量贡献占总能量43%的两个氨基酸（Phe22和Ilel04）均位于侧链上，该结果合理地给出了小菜蛾性信息结合蛋白PxylPBP2与性信息素Z9-14∶Ac的作用模式。

本研究结果表明配体与受体间并未形成氢键，而李玉华等（2016）的研究结果表明二者之间形成了氢键，表面上看似研究结果不一致，但本质上两个结论并不冲突，究其原因是本研究采用的YASARA软件模拟力场不同，以及静态模拟和动态模拟的差异所致。能量分解结果表明，能量值贡献超过1.00 kcal/mol的Leu数量有3个，说明Leu在复合物结合过程中具有极重要作用，此结论与李玉华等（2016）研究中Leu产生的疏水作用力有效促进复合物的结合结论一致。但本研究未对关键氨基酸残基进行丙氨酸突变扫描，无法进一步确定“热点”氨基酸、“暖点”氨基酸和“非点”氨基酸，以及确定关键氨基酸的能量贡献是来自于蛋白质内部其他氨基酸的作用能还是来自于外部分子的作用，均有待进一步探究。

本研究结果为进一步了解小菜蛾性信息素结合蛋白与性信息素的分子作用机制提供参考，值得一提的是，PxylPBP2与关键残基的相互作用可初步指导新型性诱剂的研发，能量分解发现产生不利于结合的负效应氨基酸等信息可用于性诱剂的修饰改造，有望在此基础上开发出新型的无害性诱剂。

4 结论

PxylPBP2与Z9-14∶Ac能形成稳定的对接复合物，范德瓦斯力和非极性溶剂力为主要内驱力，极性溶剂化能是妨碍结合的主要抑制力量， 关键氨基酸为Leu18、Phe22、Leu62、Leu71、Ile104、Met124和Phe128，能量贡献最大的两个关键氨基酸（Phe22和Ile104）位于侧链上。

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