基于NGS技术的仔猪腹泻病毒检测

罗文涛 何启盖 陈芳洲 李 静 周杰珑

(1. 西南林业大学生命科学学院，云南 昆明 650224；2. 华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，湖北 武汉 430070；3. 华中农业大学动物医学院，湖北 武汉 430070)

猪腹泻病对我国乃至全球生猪产业危害巨大[1]，造成猪群腹泻的病原主要是病毒，其次是细菌和寄生虫等[2]。猪传染性胃肠炎病毒 (TGEV)、猪流行性腹泻病毒 (PEDV)、猪A群轮状病毒 (PoARV)、猪C群轮状病毒 (PoCRV)、猪圆环病毒2型 (PCV2) 是常见的病毒性腹泻病原[3-4]。针对病毒性病原的常规检测方法包括：病毒分离鉴定、常规PCR、荧光定量PCR、中和试验、间接免疫荧光 (IFA)、ELISA等方法，但是以上方法都建立在已获得病毒基因序列和相应抗体的基础上，无法检测未知的病毒。

下一代测序技术 (NGS) 又称第2代测序或高通量测序，是新世纪开始发展起来的新测序技术，在2007年NGS被 《Nature Methods》 评选为生物领域影响力最大的突破性技术[5]。NGS的发展为生物学领域的研究提供了新的思路，在微生物、植物、人类疾病方面都得到了广泛应用，近几年在兽医领域也愈发受到重视，开始在与动物疾病相关的病原学、基因组学、流行病学等领域得到应用。基于NGS发展起来的病毒宏基因组学实现了对海洋、污水、淡水湖[6-7]及蝙蝠、火鸡、猪等动物的组织、粪便、血液[8-10]中病毒群落的宏基因组学分析。该技术具有高通量、高精度、高效率等1代测序不可比拟的优势，可以一次性检测出环境(有机环境和无机环境)中的所有病毒核酸，有助于同时检测多种猪群疾病和发现新的病原。本研究通过采集四川省某反复暴发腹泻猪场的仔猪肠道样品，进行NGS测序分析，再利用常规PCR方法对NGS结果进行验证，找到引发该猪场腹泻问题的病毒，为相关猪场后期免疫方式及程序提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2016年10月于四川省某反复出现2～4日龄仔猪腹泻的猪场采集了9份发病仔猪全部肠道组织，所有肠道组织混合匀浆，反复冻融3次，进行NGS样品处理。

1.2 主要试剂

DNase I、RNase A、DNTPs、Recombinant RNase Inhibitor、M-MLV RTase、Klenow fragment购自大连宝生物公司 (TaKaRa)。Phi29DNA polymeras购自北京NEB公司。DNAeasy Blood & Tissue Kit、RNeasy Mini Kit购自德国QIAGEN公司。AxyPrep Plasmind Minirep Kit、AxyPrep DNA Gel Extraction Kit购自Axygen (杭州) 公司。2 × Master Mix购自TIANGEN公司。

1.3 引物设计

随机引物及特异性引物由南京金斯瑞生物科技公司合成，PEDV检测引物根据其M基因[11]设计，F: TTCGGTTCTATTCCCGTTGATG, R: CCCATGAAGCACTTTCTCACTATC，产物668 bp；PEDV测序引物根据其S基因设计，F: TTGAAGAATGGTAAGTTGC, R: GCACTAGTAACATTAAG，产物708 bp；PCV3的检测引物为：F: ATTGAACGGTGGGGTCATATGTGTTG, R: TAAGCCCTGGCACGCCAACCACTTC，产物374 bp。

1.4 仪器设备

PCR仪由美国Bio-Rad公司制造；恒温水浴锅由富华仪器有限公司制造；超净工作台由北京东联哈尔仪器有限公司制造；常温或冷冻离心机由德国Eppendorf公司制造；-80 ℃超低温冰箱由Thermo公司制造；Nanodrop 2000分光光度计由Thermo公司制造；琼脂糖凝胶电泳仪由北京六一仪器厂制造。

1.5 实验方法

1.5.1NGS测序样品制备

将组织匀浆液12 000 r/min离心5 min后，上清液经0.45 μm、0.22 μm的滤器过滤除菌，备用；取滤液130 μL加入15 μL 10 × DNase I buffer、4 μL DNase I、1 μL RNase A，共计150 μL体系，37 ℃持续1 h进行外源核酸消化；消化完毕，应用QIAGEN DNeasy Blood & Tissue Kit病毒基因组提取试剂盒提取猪粪便中病毒群落的DNA；应用 QIAGEN RNeasy Mini Kit病毒基因组提取试剂盒提取猪粪便中病毒群落的RNA，取13 μL RNA，加入1 μL随机引物、0.5 μL M-MLV RTase、1 μL dNTPs，42 ℃金属浴1 h；75 ℃灭活M-MLV RTase活性10 min，反转录成sscDNA；sscDNA使用Klenow fragment在37 ℃反应1 h，合成dscDNA；将提取的DNA及dscDNA进行单引物扩增 (SISPA)，产物经纯化、浓缩后送至南京诺禾致源生物科技有限公司进行宏基因组建库测序。

1.5.2常规PCR检测

针对NGS分析得到的病毒信息，使用常规引物进行特异性检测，引物序列见1.3。PEDV-M反应条件为：94 ℃，5 min →(94 ℃, 50 s → 55 ℃, 1 min → 72 ℃, 1 min)35个循环 → 72 ℃, 10 min → 16 ℃保存。PEDV-S反应条件为：94 ℃, 4 min →(94 ℃, 30 s → 56 ℃, 30 s → 72 ℃, 45 s) 35个循环 → 72 ℃, 10 min → 16 ℃保存。PCV3反应条件为：94 ℃, 5 min →(94 ℃, 30 s → 56 ℃, 30 s → 72 ℃, 40 s) 35个循环 → 72 ℃, 10 min → 16 ℃保存。

2 结果与分析

2.1 NGS检测结果

样品中共获得1 388 488条reads，其中997 082条注释到细菌 (Bacteria)，占比72%；53 805条注释到古细菌 (Archaea)，占比4%； 334 584条注释到病毒，占比24%。在病毒reads中Caudovirales占比达94%，主要是为噬箘体目的一些序列，见图1a；猪流行性腹泻病毒 (PEDV) reads为2 352条，占病毒reads的0.7%，占整个样品的0.2%，见图1b。

在样品中还存在1%的reads属于Circoviridae SFBeef，其占到了病毒reads的5%，通过查看该reads的解释可知这是属于环病毒科 (Circoviridae) 的一种新型病毒，其reads经拼接后可知该新型环状病毒即为猪圆环病毒3型 (PCV3) (图1c)。

2.2 病毒PCR特异性检测与分析

2.2.1PEDV验证与分析

根据NGS分析得到的结果，合成常规引物对PEDV进行常规检测，得到的结果如图2a所示，可以看到出现约668 bp的目的条带，常规检测与NGS检测结果一致。对该PEDV阳性病料扩增PEDV S1基因，得到结果如图2b，将扩增产物送至武汉擎科生物科技有限公司测序，依据S1基因测序结果构建系统进化树如图3。从系统进化树中可以看到该样品中的PEDV与该猪场此前送检的PEDV为相同毒株，且该场PEDV毒株为独立的1个分支，可能为一新型变异毒株，这也揭示了为什么疫苗无法完全控制该场腹泻反复暴发的原因。

图2 样品S中PEDV M基因与S基因扩增结果Fig.2 The detection result of PEDV M gene and S gene

●：该样品来源猪场此前所测得的序列；▲：本样品中测得的序列。

2.2.2PCV3验证与分析

根据PCV3 ORF2基因设计特异性引物，进行常规PCR检测，凝胶电泳结果如图4。

由图4可知，NGS检测结果与特异性PCR检测结果一致，且扩增产物测序结果说明样品中确定存在PCV3。本研究利用PCV3的reads成果拼接出该病毒的一条全基因组，据该全基因组构建的系统进化树如图5。在亲缘关系上与韩国KU-1506 (NCBI登录号：KY996345.1) 最为接近。

图4 PCV3扩增后电泳图Fig.4 Electrophoresis analysis of PCV3

▲为本研究获得的毒株。

3 结论与讨论

在临床样品的病毒reads中噬菌体 (Phage) 占比94%，噬箘体在1915年在英国被发现[12]，1917年被命名为噬箘体，即为吞噬细菌之意[13]，噬箘体是一种细菌病毒，具有杀死细菌的功能[14]，在调节菌群结构和功能中发挥着巨大作用[15]。样品中的噬菌体占比较大，这是因为腹泻样品主要为仔猪肠道，肠道中存在大量细菌，相应的也存在大量噬菌体，噬菌体与宿主之间并不是完全的捕食性关系，大多维持平衡的共生状态，根据环境决定是否发生裂解-溶原经过[16]。

PEDV属于尼多病毒目 (Nidovirales)，冠状病毒科 (Coronaviridae)，冠状病毒属 (Alphacoronavirus) 的一种单链RNA病毒[17]。PEDV可引起猪流行性腹泻 (PED)，PED主要导致一周龄内的仔猪腹泻，同时伴随呕吐、厌食、脱水和体重减轻。PEDV的 病理变化主要是导致猪空肠和回肠的肠绒毛萎缩和脱落[18]。PEDV自2010年来先后在广东、河南、武汉、四川等地被检测到[19]。成为近十年我国仔猪腹泻的主要病原。本研究中发现猪群感染PEDV导致的腹泻，并且进化树分析发现该场PEDV属于独立的一个分支，所以该场注射的疫苗后防控效果不佳。

PCV3是一种单链环状DNA，全基因组具有2000个核苷酸，在复制期间单链转化为双链DNA，并具有3个开放阅读框 (ORF)。ORF1是最大的开放性阅读框，并且编码与圆环病毒复制相关蛋白，ORF2编码衣壳蛋白，ORF3编码的蛋白还不清楚[20-21]。Phan等于2016年通过NGS技术首先在患有心肌炎的猪群样品中检测到该病毒[20]，同年Palinski等也在猪皮炎与肾脏综合征 (PDNS) 样品猪检测到PCV3[21]。于2016年报道了国内首例PCV3[22]，随即韩国及波兰均有在猪群中检测出PCV3的报道[23-25]。研究显示在肺脏、脑、淋巴结、扁桃体、血清等样品中均可检出PCV3，阳性猪群临床症状包括腹泻、繁殖障碍、断奶仔猪多系统衰竭综合征 (PMWS) 等[23]。目前PCV3的致病性还不明确，其和猪群腹泻之间是否有直接联系还不清楚。但是猪圆环病毒2型 (PCV2) 临床上可以引起猪群腹泻[26]，并且具有免疫抑制的作用[27]，使得感染其他疾病的可能性增加，PCV3可能存在与其相似的致病机制。PCV3可以在肠道组织中检出，提示其肠道致病性的可能。

通过本研究证实了NGS技术在猪群疾病检测中应用前景巨大，同时证明临床腹泻仔猪肠道中存在PEDV与PCV3混合感染的情况，丰富了对于猪群腹泻疾病病毒感染情况的认知。但是目前NGS技术用于疾病检测价格相对较高，且周期较长，在后期实现实验室建库自主化之后，可以大大降低时间成本和经济成本，可在猪群复杂临床症状的诊断中推广使用。