越桔拟茎点霉引起欧美杨I-107溃疡病发生的研究

杨鹤同 赵 楠 赵桂华

(江苏农林职业技术学院，江苏 镇江 212400)

欧美杨I-107 (Populus×euramericana‘74/76’) 是山东省临沂地区主栽树种，占杨树栽培面积的90%。欧美杨I-107溃疡病主要发生在春季杨树造林地，高速公路和乡间公路杨树绿化带栽种的1年生幼树，发病期为4—6月，发病高峰期在4月下旬至5月上旬。2011年在山东费县和沂南县的调查显示，溃疡病斑的数量最多可达26个/株，发病率为100%，个别造林地的死亡率可高达90%，造成很大经济损失。

在我国，引起杨树溃疡病的病原真菌有十多属、数十种，其中拟茎点霉属 (Phomopsis) 是一类重要的病原菌，主要引起杨树 (Populus) 树干和枝条溃疡病，在温带和亚热带的杨树栽培区尤为常见。拟茎点霉属是一个大属[1]，有976个种、变种和专化型，我国记载了83种[2-3]。其中在杨树上有大孢拟茎点霉 (Phomopsismacrospora)[3-6]、杜仲生拟茎点霉 (P.eucommiicola)[7]、杨生拟茎点霉 (P.populina)[8]、葡萄拟茎点霉 (P.putator)、淡白色拟茎点霉 (P.pallida) 和伊特鲁里亚拟茎点霉 (P.tirrenica)，矩园形拟茎点霉 (P.oblonga)[9]和Phomopsissp.[10-11]7种，都能引起杨树溃疡病；越桔拟茎点霉 (P.vaccinii) 最早报道的寄主是越桔属植物，也能引起蓝莓 (Vacciniumuliginosum) 的枝枯病[12]。有性世代为子囊菌亚门的间座壳属 (Diaporthe)，在自然界罕见。

引起杨树溃疡病的病原菌有多种，症状和病症各异，同种病原真菌在不同的寄主上表现症状有差异，不同病原菌在相同寄主上可出现相同症状；有些杨树溃疡病有复合侵染和潜伏侵染现象，但只有1种病原菌是主要病原。为研究欧美杨I-107溃疡病，本研究对病原菌进行分离培养、纯化，形态测量、描述，DNA分子测序和致病性试验，确定病原种类，为病害防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 标本采集

2010年5月—2012年9月，分别在山东省临沂市沂南县、沂水县、蒙阴县、费县、莒南县、兰山区和罗庄区对欧美杨I-107是否发病进行7次随机调查，对1年生发病较重的造林幼树进行重点调查。选择具有典型溃疡病症状的树干或枝条，用手锯或修枝剪采集20～25 cm长的木段，每个调查地点采集5～10段，带回实验室后放在冷藏箱内 ((4 ± 1) ℃) 进行保存，供分离培养使用。

1.2 实验方法

1.2.1病原菌分离培养与纯化

将标本病斑表面用70%酒精棉球消毒3次，待干燥后用灭菌后的解剖刀去掉表面树皮，挖取病健交界处的组织 (约3 mm × 3 mm的小块)，转移到PDA培养基上，5～6块/皿，共分离50～55皿；将培养皿放在PRX-250A型智能人工气候箱 ((25 ± 1) ℃，相对湿度 (RH) 70%，黑暗) 内培养。第5天开始观察，记录分离到的真菌、细菌菌落数量和形态，统计各种真菌的出现频率，并进行编号。用挑针挑取不同的菌落边缘的菌丝，转移到PDA平板上进行纯化，转管保存于4 ℃冷藏箱中待用。

1.2.2致病性实验

将出现频率较高的菌株PH-01、PH-02和PH-03在PDA平板上培养5 d，培养条件同1.2.1；用灭菌的打孔器 (直径5 mm) 在菌落边缘打成菌饼，以保证每一个伤口的接种量相同。

于2012年8月10日，在山东省临沂市林科所苗圃，选择地径1～1.3 cm的1年生欧美杨I-107树苗，分别用PH-01、PH-02和PH-03菌株进行接种。在每棵杨树苗的中下部，离地面约50 cm处，用灭菌的解剖刀将树皮切成一个 “T” 型伤口，深至木质部，用解剖刀将树皮掀开，把带有PDA培养基菌饼放入 “T” 型伤口中，接种处蘸有无菌水的棉球覆盖保湿，其上再用塑料布包扎。每种真菌接种30株，每株杨树苗的中下部位接种1处。接种5 d后，检查接种伤口的变化，以后每隔10 d检查1次，记录发病情况，共检查3次；用无菌水脱脂棉包扎的伤口作CK。

1.2.3病原菌鉴定

1) 形态鉴定。将供试病原菌株接种在PDA培养基上，放在 (25 ± 1) ℃的PRX-250A型智能人工气候箱 (RH 70%，黑暗) 内培养14～21 d，待产生成熟分生孢子后，做成临时玻片，在德国蔡斯 (Zeiss Imagers. A1) 光学显微镜下测量 (n=30个) 分生孢子器、分生孢子梗和分生孢子的形态、大小，并拍照，根据相关资料进行形态学比对[13-14]。

2) DNA测序。DNA提取，PCR 扩增和测序反应的实验方法、步骤参照文献 [15]，测序结果通过NCBI的Blast检索系统进行序列同源性比对。

2 结果与分析

2.1 症状描述

调查结果表明，该病原菌主要为害1～2年生的欧美杨I-107杨树造林苗主干，症状初期为小的、浅黄色的下陷溃疡斑，主要分布在主干中下部，每棵树有3～26个病斑不等，最大可达5～7 cm × 1～2 cm。在发病严重时，2个病斑的边缘汇合成大病斑，可达10～14 cm × 1.5～2 cm；树皮坏死，表面干燥，黄褐色，形成许多突起、圆锥状的小点，即分生孢子器 (图1a)，在天气潮湿时，会产生白色、卷须状的分生孢子角 (图1b)。

图1 越桔拟茎点霉引起的欧美杨I-107溃疡病症状Fig.1 Symptoms of canker caused by Phomopsis vaccinii on Populus × euramericana ‘74/76’

2.2 病原菌分离

本研究对标本进行7次分离，共2 185块组织。由表1可知，其中2 025块组织长出真菌，占92.7%；细菌133块，占6.1%；未长任何真菌和细菌37块，占1.7%。杨树干内以真菌为主，细菌数量相对较少，说明杨树溃疡病病原菌的多样性。通过2年不同时间对溃疡病组织分离结果可以看出，真菌数量占90%以上，说明杨树体内存在大量真菌菌株；其中，在5月的3次分离得率稳定在92%～93%，6月的2次分离得率在90%左右，7月份的2次分离得率为93.4%～97%，说明7月份的真菌菌株相对较多。细菌以6月下旬数量最多可达8.2%，7月下旬的分离得率仅为2.4%。

由表2可知，2 025个真菌菌落隶属于9个属，其中越桔拟茎点霉1 378块，占68%，聚生小穴壳355块，占17.5%，镰刀菌73块，占3.6%，其他真菌的出现率都在3%以下。在这些真菌中，越桔拟茎点霉 (Phomopsisvaccinii) 和聚生小穴壳 (Dothiorellagregaria) 被分离到的频率最高，85.5%，它们是杨树和其他树木上的溃疡病菌，接种试验也证明，前者的致病性高于后者；镰刀菌 (Fusariumsp.)、顶孢霉 (Acremoniumsp.)、可可球二孢 (Lasiodiplodiatheobromae) 也能引起树木枝干病害，但对杨树的致病性较弱，而交链孢 (Alternariasp.)、黑孢菌 (Nigrosporasp.)、弯孢菌 (Curvuriasp.) 常引起叶部病害，本次未作接种试验；青霉 (Penicilliumsp.) 是杨树中的内生菌。

表1 欧美杨I-107溃疡病斑分离结果Table 1 Isolation results of Populus × euramericana ‘74/76’ canker

表2 欧美杨I-107溃疡病斑中的真菌种类Table 2 Fungal species of Populus × euramericana ‘74/76’ canker

2.3 病原菌鉴定

2.3.1形态鉴定

形态鉴定结果为越桔拟茎点霉PhomopsisvacciniiShear, United States Department of Agriculture Technical Bulletin 258: 7-8 (1931)[1,16]。由图2可知，菌落初为白色，渐变为灰黄色至灰褐色 (图2a)，日生长量为0.7 cm。5 d开始产生黑色子实体，10 d以后会产生乳白色至灰白色的分生孢子堆(图2b)。分生孢子座为真子座，在PDA上表生或半埋生，黑色，球形或不规则形，单腔室 (图2c)，0.2 mm × 0.5 mm；分生孢子座壁厚，由10层以上细胞组成，外壁褐色至黑色；在表面有疏松菌丝，单孔口，圆形。分生孢子梗纺锤形或圆柱形，15～25 μm × 1.2～1.7 μm，大多为1～2个分隔，少数3个分隔，有分枝 (图2d)，长在腔室的内壁上；产孢细胞内生芽殖型、瓶梗状，10～15 μm × 1～1.5 μm。分生孢子有两种类型，α型分生孢子单细胞、无色，纺锤形，具2个油滴 (图2e)，大小为6.9～10.8 μm × 2.1～3.3 μm，平均8.1 μm × 2.8 μm；β型分生孢子无色、丝状，直或弯曲，无分隔，大小为17.3～24.2 μm × 1.3～1.8 μm，平均20.3 μm × 1.3 μm (图2f)。上述测量形态特征与相关资料记载的越桔拟茎点霉相符[14]。

虽然越桔拟茎点霉分生孢子座大小[16]与葡萄拟茎点霉相似，但β分生孢子比葡萄拟茎点霉小11 μm，差异较大；与淡白色拟茎点霉的β分生孢子相似，而分生孢子梗较短[17]。

2.3.2分子鉴定

通过对越桔拟茎点霉菌丝的DNA提取，用ITS1和ITS4通用引物进行PCR扩增，得到长度为538 bp的特异性DNA片段。扩增ITS区全序列电泳图，如图3。对扩增片段进行测序，用NCBI的Blast在Genbank中搜寻相似序列，其结果与Genbank中登陆号为EU520050的DNA测序结果相同，再通过NCBI的Blast检索系统进行序列同源性比对显示，与Genbank中登陆号为EU520050菌株的18S核糖体RNA基因的部分序列相似；内转录间隔区1，5.8S核糖体RNA基因全序列，内转录间隔区2全序列和28S核糖体RNA基因部分序列的同源性为99%。因此，确定引起欧美杨I-107溃疡病菌为越桔拟茎点霉菌。

a. 初期白色菌落；b. 黑色子座、分生孢子器和淡黄色的分生孢子堆；c. 分生孢子器；d. 分生孢子梗；e～f. α型和β型分生孢子。

图3 ITS 1和ITS 4区域的PCR扩增产物电泳图Fig.3 Electropherograms of PCR amplification products in ITS 1 and ITS 4 regions

2.4 致病性分析

由表3可知，在接种后的第5天，去掉包扎伤口上面的塑料布时，发现有9株接种PH-01的伤口已出现坏死 (占30%)，并伴有轻微腐烂味道；第10天有19个伤口出现腐烂 (占63.3%)，并向四周扩展1～2 cm，病斑下陷明显，水渍状；第20天检查全部发病，接种症状与自然发病症状基本相似，最大病斑可达5.5 cm × 1.8 cm。PH-02和PH-03的致病性较PH-01弱，接种30 d后份发病率分别为56.7%和33.3%，且PH-03的病斑扩展很小，只限于接种伤口处。接种伤口发病时间不同，可能与3个菌株致病性和苗木生长势有关系。第30天检查时，CK中有1棵树的伤口被其他真菌感染，病斑没有向外扩展，其他CK接种伤口长出了愈伤组织。

表3 3种杨树真菌接种欧美杨I-107杨苗的致病性试验Table 3 Pathogenicity tests with 3 Poplius fungi inoculation on Poplius × euramericana ‘74/76’ seedlings

在接种试验完成后，分别对PH-01、PH-02和PH-03菌株接种后形成的溃疡斑进行了再分离，在接种PH-01的病斑上得到了与原来接种菌株相同的真菌，符合科赫法则。根据致病性强弱，确定PH-01是欧美杨I-107溃疡病的主要病原菌，即越桔拟茎点霉；PH-02和PH-03分别是聚生小穴壳和镰刀菌，虽然这2种真菌都能致病，但比越桔拟茎点霉的致病性更弱，不是主要病原菌。

3 结论与讨论

共分离临沂市7个县、区杨树溃疡病组织2 185块，其中长出真菌的组织2 025块，占92.7%，隶属于9个属的真菌，出现最多的是越桔拟茎点霉，占68%，其次是聚生小穴壳，占17.5%。通过形态学观察、测量、描述、DNA测序和致病性试验，确定引起欧美杨I-107溃疡病的真菌为越桔拟茎点霉菌，该病原菌在我国欧美杨I-107上属于首次报道，由它引起的欧美杨I-107溃疡病为我国杨树新病害。

越橘拟茎点霉最早报道是它能引起越桔 (Vacciniumvitis-idaea) 的果腐病，并与大果越桔 (Vacciniummacrocarpon) 和蓝莓的一些病害有关[18]，也是蔓越莓储藏时期的重要病原菌[19]。Wilcox[20]用蓝莓枯枝上的分离物，大果越桔枝枯病、果腐病菌孢子悬浮液或菌丝接种健康蓝莓证明，在大果越桔上Phomopsissp.与蓝莓枯梢病原菌是同一种真菌[1]。2005年在欧洲发现了越桔拟茎点霉，并将它列为欧洲的植物病原菌检疫对象[21]。Farr等[22]从美国东部的高丛越桔 (Vacciniumcorymbosum) 和小红莓 (Vacciniummacrocarpon) 枝条上分离到40个拟茎点霉属菌株，根据形态学和ITS rDNA测序相似性，大多数菌株为越桔拟茎点霉。

在我国，越桔拟茎点霉引起欧美杨I-107溃疡病发现于2010年，在鲁东南和苏北地区新造林地里发生普遍，导致造林成活率下降，造成直接经济损失，应该引起高度警惕，查清该病原菌的来源和对杨树造林的危害以及潜在的流行爆发趋势。该病原菌是否也为害其他植物的研究甚少，越桔拟茎点霉除了为害欧美杨I-107和蓝莓外，是否还能为害其它植物，有待证实。