马尾松抗性家系感染松材线虫后酶活性变化研究

刘洪剑 王曦茁 汪来发 徐六一 李成录 曹业凡

(1. 安徽省林业科学研究院，安徽 合肥 230031; 2. 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所，北京 100091；3. 延边州农业技术推广总站，吉林 延边 133001)

马尾松 (Pinusmassoniana) 是我国南方地区重要的荒山造林和主要用材树种。自1982年在我国发现松材线虫病以来[1]，已扩展蔓延到我国南方多个省份，造成我国南方地区马尾松大量死亡，严重地影响我国林业生产及生态安全。目前，在生产上仍缺乏有效和经济的防治松材线虫病方法。选育抗松材线虫病的马尾松并应用于林业生产可能是有效防治松材线虫病的途径之一[2]。植物在抵抗病原物入侵的过程中，植物需要通过复杂的新陈代谢进行自我保护，这一过程是通过各种酶催化生理反应来完成的。过氧化氢酶 (CAT)、苯丙氨酸解氨酶 (PAL)、过氧化物酶 (POD) 和多酚氧化酶 (PPO) 等是植物体内重要的防御酶，参与植物活性氧清除及与抗病相关物质的合成，能够抵御活性氧、氧自由基形成对细胞膜系统的伤害，进而增强植物对病害的抵抗能力[3-4]。但不同植物在抗病反应中酶的变化存在不同[5-6]，有关抗性马尾松家系防御酶的研究较少。

安徽省林业科学研究院自1999年开始对抗松材线虫病马尾松家系进行选育，并已成功选育出一些抗松材线虫病的家系[7-8]。本研究通过分析松材线虫 (Bursaphelenchusxylophilus) 侵染抗性马尾松家系后CAT、PAL、POD和PPO等防御酶活性变化规律，研究抗松材线虫病的生理生化机制，筛选松材线虫病抗性早期鉴定生理指标，为深入了解线虫和寄主之间作用机制和早期抗性选育奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1松材线虫

供试松材线虫南马株系来自江苏南京 (118°46′E, 32°03′N)，寄主为马尾松，将线虫接种到长满灰葡萄孢 (Botrytiscinerea) 的PDA平板上，25 ℃培养，用贝曼漏斗法[9]收集线虫，备用。

1.1.2植物材料

4个供试抗病马尾松家系分别是休33-2、休15-5、广50-4、广59-3，均栽植在安徽省林业科学研究院苗圃，栽种年份相同，生长环境相似，连续4年人工接种松材线虫，4年接种过程中均未表现任何感病症状，具有可靠性和稳定性。湖北省恩施马尾松感病家系为CK。

1.2 实验方法

1.2.1接种方法

选取生长基本一致的抗病及感病马尾松幼树10株，在幼树年生侧枝茎干一侧枝条采用人工皮接法接种，每株接种2 000条松材线虫。

1.2.2预处理

参考Lamb等[10]的方法，于接种0、6、24、72、120、168 h后采集各处理枝条，在冷冻状态下去掉枝条韧皮部，从木质部外围到木心切片剪碎，放入研钵中加入少许石英砂，在冰浴上研磨成匀浆，备用。

1.2.3酶测定方法

CAT活性测定参照文献 [11]。以每分钟 A240减少0.1酶量为1个酶活性单位，计算CAT活力。

PAL活性测定参照文献 [11]。本实验取预处理材料为0.5 g，在290 nm处测定吸光值，以每小时OD值变化0.01为1个酶活单位，计算PAL活力。

POD活性测定参照文献 [12]。本实验取预处理材料为0.5 g，470 nm波长下测定吸光度。以每分钟OD值变化0.01为1个酶活单位，计算POD活力。

PPO活性测定参照文献 [13]。于525 nm波长处测定吸光值，以每分钟OD值变化0.01为1个酶活单位，计算PPO活力。

1.3 数据分析

采用DPSv 7.05版本Duncan新复极差法对4种防御酶活性进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 过氧化氢酶活性变化分析

接种后各家系枝条中CAT活性变化见图1。

图1 接种后各家系枝条中CAT活性变化Fig.1 Changes in CAT activity in branches after inoculation with B.xylophilus

由图1可知，无论CK或各抗性家系在接种松材线虫后，CAT的活性随着时间的推移都呈现先下降后上升趋势，说明CAT在马尾松抗松材线虫病中起到一定作用。枝条中CAT活性降低可能与接种松材线虫时在马尾松枝条上造成伤口有关。前120 h， CK与4个抗性家系枝条中CAT活性虽有上下起伏，但差异不明显；168 h后，CK中CAT活性没有明显变化，广50-4和广59-3枝条中CAT活性明显上升，分别比CK升高146.8%和321.3%，说明这2个家系对松材线虫具有较强抗性，而另2个家系枝条中CAT活性相较CK仍无明显变化。而不同时间段、不同家系间CAT活性差异均不显著。

2.2 苯丙氨酸解氨酶活性变化分析

接种后各家系枝条中PAL活性变化见图2。

图2 接种后各家系枝条中PAL活性变化Fig.2 Changes in PAL activity in branches after inoculation with B.xylophilus

由图2可知，在马尾松枝条接种松材线虫6 h，此时组织中PAL活性达到最高值，CK和广50-4、广59-3、休15-5、休33-2枝条中酶活性分别为0.525、0.581、0.587、0.344、0.269 U/(g·min)，然后迅速下降，随后各抗性家系枝条中PAL活性均有上升趋势，到168 h后4个抗性家系广50-4、广59-3、休15-5、休33-2枝条中酶活性比CK分别升高200.0%、97.6%、106.4%、142.4%，且与CK的差异显著 (P< 0.05)。PAL活性在不同时间段差异不显著，但在不同家系间差异极显著 (P<0.01)。

2.3 过氧化物酶活性变化分析

接种后各家系枝条中POD活性变化见图3。

图3 接种后各家系枝条中POD活性变化Fig.3 Changes in POD activity in branches after inoculation with B.xylophilus

由图3可知，各抗性马尾松抗性家系和CK枝条中接种松材线虫后，枝条中POD活性出现上升、下降后再上升趋势，并且在接种120 h后，各抗性家系枝条中POD活性增加趋势明显高于CK，168 h后，广59-3、休15-5、休33-2枝条中POD酶活性比CK分别升高235.3%、570.6%、290.6%，说明POD在马尾松松材线虫病抗病性中起到明显作用。POD活性在不同时间段差异不显著，但在不同家系间差异极显著 (P< 0.01)。

2.4 多酚氧化酶活性变化分析

接种后各家系枝条中PPO活性变化见图4。

图4 接种后各家系枝条中PPO活性变化Fig.4 Changes in PPO activity in branches after inoculation with B.xylophilus

由图4可知，各马尾松抗性家系和CK在枝条接种松材线虫后，随着时间变化，组织中PPO都有先上升后下降然后再上升的趋势，并且各马尾松抗性家系枝条中PPO活性明显高于CK。在马尾松枝条在接种松材线虫120 h后降到最低值，CK和广50-4、广59-3、休15-5、休33-2枝条中酶活性分别为0.028、0.058、0.051、0.035、0.056 U/(g·min)，之后又逐渐上升，到168 h后分别达到0.037、0.072、0.077、0.047、0.067 U/(g·min)，各抗性家系枝条中PPO酶活性在168 h比CK升高94.6%、108.1%、27.1%、81.1%。不同时间段、不同家系间PPO活性差异均极显著 (P< 0.01)。

3 结论与讨论

松材线虫侵染马尾松后，马尾松接种松材线虫后有机酸活性、酚类和酶类等部分生理生化指标发生变化[14-15]。松材线虫侵染松树引起松树发病、枯萎死亡，是系统性侵染病害，松材线虫进入木质部以后，在木质部生长、繁殖及移动，引起木质部生理发生变化，从而引起整个树体生理的变化，包括叶子生理的变化，因此叶子和木质部的变化有可能不一致，陈玉惠等[14]的研究证实了马尾松幼苗接种松材线虫后，其茎、叶中的POD和PPO活性在病程中存在差异。本研究中，接种后木质部防御酶的变化，可能是松树对松材线虫侵染的直接生理反应。

在正常情况下植物体内的活性氧与其酶促清除系统保持着动态平衡，但当受到病原真菌、细菌、病毒和线虫侵染时，植物体内可迅速产生大量活性氧。这些活性氧在植物体内积累可对松材线虫产生毒害作用，引起植株的过敏性反应和诱导植株产生抗性。前120 h各家系枝条中CAT活性变化不大，差异不明显；168 h时，CK中该酶没有明显变化，广50-4和广59-32枝条中该酶的活性明显上升，说明这2个家系中CAT参与了抗病反应。与抗性植株在接种南方根结线虫 (Meloidogyneincongnita) 后，CAT基因活性并且明显高于感病植株是一致的[16]。另2个家系枝条中CAT活性相较CK仍无明显变化，5个家系的CAT的变化，说明CAT在不同马尾松的抗线虫的机制是不一致的。

PAL是植保素生物合成的关键酶，也参与了次生抗病物质木质素和酚类物质的合成与积累，被认为是一种植物防御酶[16]。在马尾松枝条接种松材线虫6 h后，此时组织中PAL活性达到最高值，后迅速下降，随后各抗性家系枝条中PAL活性均有上升趋势，168 h后4个抗性家系广50-4、广59-3、休15-5、休33-2枝条中酶活性高于CK，且差异显著 (P< 0.05)。说明PAL活性可能与最初的松材线虫抗病反应无关，而与后期抗病反应相关。

POD是木质素合成中的重要酶，参与木质素前体物质的聚合作用，促进细胞壁木质化及其伤口附近细胞形成木栓层，增加木质化程度，从而增强植物抗病性。各抗性马尾松抗性家系和CK枝条中接种松材线虫后，在接种120 h后，各抗性家系枝条中POD活性增加趋势明显高于CK，说明POD在马尾松松材线虫病抗病性中起到重要作用。

PPO将酚类物质氧化成为对病原物有毒的醌类物质，并参与木质素合成以阻止线虫侵入[17]。本研究中，接种松材线虫后，4个抗病家系中的PPO在接种168 h前高于感病家系，不同时间段，不同家系间PPO差异均极显著 (P< 0.01)，因此，PPO可作为马尾松抗松材线虫病早期鉴定的一种有价值的重要生理指标，同时说明PPO可能与最初的松材线虫抗病反应有关。

综上所述，抗性马尾松家系对松材线虫侵染后CAT、PAL、POD和PPO 活性的变化差异可能与松材线虫诱发松树体内一系列反应，松树感染松材线虫后体内4种酶CAT、PAL、POD和PPO 活性动态变化，在一定程度上能够反映不同家系间的抗性差异，从而决定了其抗性机制的不同。

致谢：感谢中国林业微生物菌种中心保藏中心提供的松材线虫南马株系。