HPLC-ESI-MS/MS分析金钗石斛花花色苷组成及其抗氧化活性测定

宋小蒙， 王洪新，， 马朝阳， 寇兴然， 贾启海

(1.江南大学食品学院，江苏无锡 214122； 2.国家功能食品工程技术研究中心，江苏无锡 214122；3.赤水国礼金钗石斛发展有限公司，贵州遵义 564700)

金钗石斛(DendrobiumnobileLindl.)系兰科石斛属多年生草本植物，别称扁金钗、扁黄草、扁草，是名贵的中药材[1]，具有较高的食用和营养价值，其茎入药，性微寒，味甘，具有益胃生津、滋阴清热等功效[2]，主要生长在贵州、四川、广西、云南等地[3]。金钗石斛花花形俏丽，颜色鲜艳，有较高的药用价值，能够滋阴润肺、增强免疫力、抗衰老[4]等。花色苷(Anthocyanin)属于类黄酮类物质，是一种天然水溶性色素，广泛存在于植物的花、果、茎、叶中，具有清除自由基、抗炎症、降血脂等功效，受到国内外学者的广泛关注。目前发现的花色苷有20多种，以天竺葵素、矢车菊素、芍药素、飞燕草素、锦葵素和牵牛花素最为常见[5]。

当前对花色苷类化合物的研究主要集中在紫薯、蓝莓、甘蓝等物质，对于金钗石斛花花色苷组成的报道很少。本试验以贵州金钗石斛花为原料，对其进行提取纯化并使用高效液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS/MS)分析其组成，进一步通过还原力测定、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)法和2，2′-联氨-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)法对其抗氧化能力进行研究，从不同方面为贵州金钗石斛花的进一步开发和研究提供科学的依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

金钗石斛花，购自贵州省赤水国礼金钗石斛发展有限公司；AB-8型大孔树脂，购自沧州宝恩吸附材料科技有限公司；乙醇、甲酸、盐酸、氯化铁、六氰合铁酸钾、三氯乙酸(TCA)、维生素C、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和过硫酸钾均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；乙腈、甲醇为色谱纯，购自美国Tedia公司；DPPH、ABTS、水溶性维生素E(Trolox)，均购自美国Sigma公司。

Waters超高效液相色谱-质谱联用仪，购自美国Waters公司，配有可变波长紫外检测器——二极阵列管检测器(PDA)和数据处理软件Masslynx4.1工作站；DZF-6050型真空干燥箱，购自上海一恒科学仪器有限公司；AR224CN型电子天平，购自奥豪斯仪器(上海)有限公司；SHZ-DIII型循环水真空泵，购自上海羌强实业发展有限公司；Multiskan GO全波长酶标仪购自美国赛默飞世尔科技公司。

1.2 试验方法

1.2.1 花色苷的提取与纯化 将10 g金钗石斛花干粉浸于1 L 50%乙醇(0.1% HCl)中，4 ℃下遮光提取24 h，抽滤得提取液，50 ℃真空浓缩。将浓缩液上样于经过预处理[6]的 AB-8型大孔树脂，用3倍柱体积0.5%甲酸溶液洗脱树脂，去除糖和蛋白质，然后用3倍柱体积70%乙醇溶液(含1%甲酸)洗脱。洗脱液于50 ℃真空浓缩去除乙醇，真空冷冻干燥得干物质[7]。取一部分溶于水中，其余部分低温保存。

1.2.2 液相色谱条件 色谱柱：Waters Acquity-BCH C18(柱长100 mm×柱内径2.1 mm，填料的孔径为1.7 μm)，流速为0.3 mL/min，柱温为45 ℃，进样量为3 μL，检测器：二极管阵列检测器，检测波长为520 nm，梯度洗脱条件见表1。

1.2.3 质谱条件 电喷雾离子源(ESI)：正离子扫描模式，毛细管电压为3.2 kV，锥孔电压为30 V，离子源温度为100 ℃，脱溶剂温度为400 ℃，脱溶剂气流量为700 L/h，锥孔气流量为50 L/h，离子扫描范围m/z为100～2 000。

表1 梯度洗脱条件

1.2.4 还原力测定 用铁氰化钾法测定还原力[8]。取 10 mL 离心管，依次加入2.5 mL不同浓度的样品、2.5 mL 2.5 mol/L的磷酸缓冲盐溶液(PBS)(pH值为6.6)和2.5 mL 1%六氰合铁酸钾溶液，50 ℃水浴20 min；冷水冷却后，再加入2.5 mL 10%三氯乙酸(TCA)溶液，混匀，3 000 r/min下离心10 min，取上清 2.5 mL，依次加入2.5 mL蒸馏水、0.5 mL 0.1% FeCl3溶液，充分混匀，静置10 min，以水为空白、维生素C为阳性对照，于700 nm测定吸光度。

1.2.5 金钗石斛花对DPPH·清除试验 以Trolox为阳性对照，进行DPPH·清除能力测定[9-10]。在96孔板中加入 270 μL 60 μmol/L DPPH和30 μL不同浓度样品，避光反应 5 min，放入酶标仪中，于517 nm测定吸光度，并计算清除率：

DPPH·清除率=[1-(D1-D2)/D0]×100%。

式中：D1为样品与DPPH反应后在517 nm处的吸光度；D2、D0分别为空白样品、DPPH在517 nm处的吸光度。

1.2.6 金钗石斛花对ABTS+·的清除试验 以Trolox为阳性对照，进行ABTS清除能力测定[11]。将3.5 mmol/L ABTS和2.45 mmol/L过硫酸钾以2 ∶1体积比混合，避光，室温下反应12～16 h，即得ABTS+·储备液。在96孔板中加入 200 μL ABTS+·储备液和10 μL不同浓度样品，反应10 min后放入酶标仪中，于734 nm测定吸光度，并计算清除率：

ABTS+·清除率=[1-(D1-D2)/D0]×100%。

式中：D1为样品与DBTS+·反应后在734 nm处的吸光度；D2为空白样品在734 nm处的吸光度；D0为ABTS+·储备液在734 nm处的吸光度。

2 结果与分析

2.1 金钗石斛花花色苷组分分析

图1是金钗石斛花花色苷溶液在520 nm下的HPLC图谱，可以看出，金钗石斛花花色苷含有多种不同的成分，主要有13种。结合保留时间、质谱信息和相关文献[12-21]对各峰进行推测。图2为峰1的质谱图，保留时间为 8.33 min，分子离子m/z为611，碎片离子m/z为287。其中碎片离子(m/z=287)是分子离子(m/z=611)失去1分子槐糖基(相对分子量为324)所得，碎片离子(m/z=287)为矢车菊素花色苷的特征离子，因此推测峰1为矢车菊素-3-槐糖苷。

峰2的保留时间为9.62 min，分子离子m/z为449，碎片离子m/z为287。其中碎片离子(m/z=287)是分子离子失去1分子葡萄糖基(相对分子量为162)所得，碎片离子(m/z=287)为矢车菊素花色苷的特征离子，因此推测峰2为矢车菊素-3-葡萄糖苷。峰3的保留时间为12.85 min，分子离子m/z为919，碎片离子m/z为287、449、757。其中，碎片离子(m/z=757)是分子离子失去1分子葡萄糖基(相对分子量为162)所得，碎片离子(m/z=449)是分子离子失去1分子槐糖苷和1分子香豆酰(相对分子量为324+146)所得，碎片离子(m/z=287)是碎片离子(m/z=449)失去1分子葡萄糖苷(相对分子量为162)所得，m/z=287的碎片离子为矢车菊素花色苷的特征离子，因此推测峰3为矢车菊素-3-对羟基香豆酰槐糖苷-5-葡糖苷。峰4的保留时间为14.44 min，分子离子m/z为535，碎片离子m/z为287。其中，碎片离子(m/z=287)是分子离子失去1分子葡萄糖基和1分子丙二酰基(相对分子量为162+86)所得，碎片离子(m/z=287)为矢车菊素花色苷的特征离子，因此推测峰4为矢车菊素-3-O-丙二酰葡萄糖苷。峰5的保留时间为 16.50 min，分子离子m/z为757，碎片离子m/z为287、449。其中，碎片离子(m/z=449)是分子离子失去1分子芸香糖苷(相对分子量为308)所得，碎片离子(m/z=287)是m/z=449失去1分子葡糖苷(相对分子量为162)所得，碎片离子(m/z=287)为矢车菊素花色苷的特征离子，因此推测峰5为矢车菊素-3-芸香糖苷-5-葡糖苷。

其他各峰的推测方法与峰1～峰5相同，其质谱信息和推测化合物见表2，本研究仅给出峰1的MS、MS/MS图。观察发现经过酰基化的花色苷保留时间基本大于未酰基化花色苷，多酰化花色苷保留时间大于单酰化花色苷，相同种类花色苷糖基不同，保留时间也不一样。

表2 金钗石斛花中主要花色苷组分

2.2 金钗石斛花花色苷抗氧化能力测定

2.2.1 还原能力的测定 Fe3+得到电子后被还原为Fe2+，体系颜色发生改变，因此可通过颜色变化观察氧化还原状态的改变，吸光度越大说明还原力越强，利用此原理检测金钗石斛花花色苷的还原能力。从图3可以看出，在试验浓度范围内，随着样液浓度的升高，还原能力呈上升趋势，而在同一浓度下维生素C的还原力高于金钗石斛花花色苷的还原能力。

2.2.2 金钗石斛花花色苷对DPPH·的清除作用 DPPH·是一种稳定的有机自由基，醇溶液呈紫色，517 nm处有强吸收，得到1个电子后吸收消失，溶液变浅，其褪色程度与得到电子数相关，因此可利用分光光度法快速测定。从图4可以看出，石斛花花色苷与Trolox均具有较强的清除能力，且清除率随浓度增大而提高，当浓度为500 μg/mL时样液的清除率达86%。两者的半抑制浓度(IC50)分别为33.17、159.92 μg/mL。

2.2.3 金钗石斛花花色苷对ABTS+·的清除作用 ABTS+·与DPPH·类似，均为稳定的有机自由基，抗氧化能力越强，提供电子的能力越强，反应速率越快，因此可以通过测定吸光度判断其抗氧化能力大小。从图5可以看出，样液和Trolox的清除率均随浓度增大而增大，两者的IC50分别为33.55、525 μg/mL，Trolox的清除能力明显大于样液。

3 结论

本试验采用HPLC-MS/MS联用法测定金钗石斛花花色苷组分，其中矢车菊素类化合物有10种，飞燕草色素类化合物有3种，以矢车菊素类化合物为主。此外发现，酰基化的花色苷保留时间基本大于未酰基化花色苷，多酰化花色苷保留时间大于单酰化花色苷，对于相同种类花色苷，糖基不同，保留时间也不一样。金钗石斛花花色苷的还原力随着样液浓度的升高而升高，且具有较强的DPPH自由基清除能力，清除率随浓度增大而增大，当浓度为500 μg/mL时清除率达86%。金钗石斛花花色苷对ABTS+·的清除率随浓度增大而增大，其IC50为 525 μg/mL。