虾过敏DNA疫苗的设计和构建

王进军， 薛 藩

(扬州大学环境科学与工程学院，江苏扬州 225127)

虾作为海产品的主力军，其味道鲜美闻名于世，但不少人因对虾过敏而无法享用。目前，还没有针对虾过敏的治疗方法。虾过敏的主要原因是虾中存在过敏原。随着免疫学、临床医学和食品生物化学等学科和分子生物学技术的发展，不同品种的虾过敏原的性质被研究，结果表明不同品种的虾主要过敏原均为分子量36 ku组分，而且其氨基酸的组成和顺序很相似，都是肌肉中的原肌球蛋白[1-2]。这种蛋白质存在于肌原纤维中，和肌钙蛋白一起，结合在F-肌动蛋白上，形成细丝。进一步研究表明，虾过敏原的抗原表位，即能引起过敏反应的最小单位，通常为几个氨基酸的多肽或者肽段，如棕虾的抗原表位为9个肽段，这9个肽段有两大重叠区域[3-7]。

DNA疫苗即基因疫苗，是在分子生物学技术基础上发展起来的第3代新型疫苗，指的是将编码外源性抗原的基因插入到含真核表达系统的质粒上，然后将质粒直接导入人或动物体内，让其在宿主细胞中表达抗原蛋白，诱导机体产生免疫应答。抗原基因在一定时限内的持续表达，不断刺激机体免疫系统，使之达到防病的目的[8-9]。

本研究通过基因克隆技术构建虾过敏原抗原表位的DNA疫苗，通过“一珠一化合物”的分析方法获得虾过敏抗原表位的多肽的氨基酸序列，通过真核表达载体pCI neo为骨架，加上免疫相关的因子，从而构建完整针对刀额新对虾过敏的DNA疫苗[10-11]，为后续的动物试验打下坚实基础，也为探索新的海产品，尤其虾过敏的治疗提供良好方案。

1 材料与方法

1.1 虾过敏蛋白抗体的纯化

虾过敏蛋白主要是原肌球蛋白特异性抗体，收集虾过敏史的患者血清，用结合重组蛋白Mete1的溴化氰活化亲和层析凝胶4B(CNBr-activated Sepharose 4B，GE Healthcare，Piscataway，NJ)进行纯化获得。

1.2 多肽链文库的筛选

1.2.1 封闭 从4个(氨基酸肽链长度分别为8、9、12、15个氨基酸)“一珠一化合物”随机任意组合的氨基酸文库中取 25 000～30 000珠子，装入小层析柱。用含有0.1%吐温-20的5%封闭液进行封闭。

1.2.2 非特异性珠子的去除 用碱性磷酸酶耦联的抗人的二抗(1 ∶5 000 IgG-AP或1 ∶3 000 IgE-AP)4 ℃孵育1 h，PBST洗3遍，用碱性磷酸酶反应底物BCIP显色，非特异性反应的珠子会呈现出蓝色，挑出去除，层析柱留下无色的珠子。

1.2.3 特异性珠子的初筛 用患者血清纯化的抗体作为一抗(IgG为1 ∶50或 IgE为1 ∶20)4 ℃过夜孵育，PBST洗3遍，二抗用IgG-AP(1 ∶2 000)或IgE-AP(1 ∶300)4 ℃孵育1 h，PBST洗3遍，将珠子与低熔点琼脂糖胶(NuSieve GTG Agarose，Cambrex Bio Science Rockland，Inc，Rockland，MN)混合后转入平皿中，冷却10～15 min后，加入BCIP，用平板扫描仪扫1遍。2 h后用1 mol/L盐酸终止反应，再用扫描仪扫1遍。前后2次所得的图片通过软件分析，比较前后2次颜色的差异。分离出颜色差异较大的珠子(即第1次扫描无颜色或浅颜色的，第2次扫描深颜色)。

1.2.4 特异性珠子的确认 为进一步确认阳性结果，将所得珠子用盐酸胍去除颜色后按“1.2.3”节方法重复1遍，然后将含有不同多肽的珠子送至Edman公司进行测序。

1.2.5 氨基酸序列的获得 从测序公司获得最终的多肽链的氨基酸序列。

1.3 DNA疫苗的构建

1.3.1 DNA序列的获得 根据“1.2.5”节获得的氨基酸序列，按照遗传密码子推导出DNA的序列。

1.3.2 盒式片段DNA的设计 该DNA疫苗设计考虑到免疫学的需要，既要能保证正常有效地表达，又要能促进同源抗原递呈细胞有效地识别，并发挥TH1免疫识别效应。在原核和真核穿梭表达载体pCIneo作为骨架，其中包含了SV40晚期poly(A)加尾信号，在此基础上加入了促进氨基酸分泌的组织型纤溶酶原激活剂(tPA信号序列)、T肽P18mn(CKRKIHIGPGQAFYT)、在T肽的两侧加上2个CpG序列(GACGTT和GAACGTCG)、泛DR辅助T细胞表位(PADRE)和有助于翻译起始的Kozak序列[12-16]。

1.3.3 重叠PCR获得盒式片段 根据“1.3.2”设计获得全长的氨基酸序列，根据网站JCAT(http：//www.jcat.de/)优化表达的DNA序列，并检测有无稀有密码子。总序列长 198 bp，利用重叠PCR的方法，依次设计6段60 bp左右，每段两侧各有20 bp的重叠序列，在第1个片段外侧加上XhoⅠ和最后1个片段加上XbaⅠ的酶切位点。合成各核苷酸链后，按相同的浓度加入PCR运行10循环(94 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s)。然后用2个共同的引物(GCTAGCCTCGA-GGCCACCATG和GCCCGGGTCGACTCTAGA)在常规PCR条件下扩增30循环(94 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s)，获得盒式片段全长。

1.3.4 DNA疫苗的获得 用“1.3.3”获得的DNA片段，用XhoⅠ和XbaⅠ酶切后连接到pCIneo表达载体，转化进大肠杆菌感受态DH5α，涂含氨苄青霉素的LB平板，37 ℃过夜培养，挑选阳性克隆提取质粒，送测序公司测序确认。

2 结果与分析

2.1 “一珠一化合物”法获得多肽

根据图1试验过程，运用“一珠一化合物”的方法进行筛选。由表1可知，阳性结果氨基酸测序，获得不同长度的多肽，共20个，肽链长度为8个氨基酸的多肽4个，肽链长度为9个氨基酸的多肽5个，肽链长度为12个氨基酸的多肽7个，肽链长度为15个氨基酸的多肽4个。

2.2 DNA疫苗关键盒式片段的获得

所得20个多肽，以及相关的有助于DNA疫苗发挥更好作用的元件的氨基酸序列，到JCAT网站上按照表达模型偏好选择正确的DNA序列，设计引物，用重叠PCR(图2)后获得完整片段(表2、图3)。

2.3 DNA疫苗完整质粒构建

将PCR产物和pCIneo质粒分别酶切后过夜连接获得完整的DNA疫苗质粒，由表3、图4可知，该疫苗质粒包含了KOZAK序列、Th-PADRE、CpG1、Th-P18mn、CpG2、tPA信号序列、虾抗原表位和SV40晚期poly(A)加尾信号，获得20个虾过敏抗原表位的DNA疫苗质粒。

3 讨论

虾过敏蛋白主要是原肌球蛋白特异性抗体，该蛋白能引起患者的过敏反应，常见的是皮肤反应，如荨麻疹和血管性水肿，也有的引起胃肠道的不适反应，如恶心、呕吐、腹痛和痉挛。过敏的症状因不同个体而有不同的差异， 一般过敏的同时，患者血清中的IgE水平也跟着升高。如果研制出虾过敏的疫苗，很多人不会因为过敏而望虾却步。

表1 筛选所得的抗原表位氨基酸序列

DNA疫苗作为一种新型的疫苗，克服了传统疫苗的成本高、安全性差、效果不理想、适用范围不广等不足，其关键是抗原表位的获得和合适的载体。本研究采用的“一珠一化合物”化学筛选方法，特异性强、灵敏度高，能利用虾过敏病人的血清纯化所得的抗体，从库中筛选出与其反应的抗原表位多肽。

为了促进免疫反应的效果，在抗原表位的前后加入了KOZAK序列、Th-PADRE、CpG1、Th-P18mn、CpG2、tPA信号序列、SV40多肽加尾信号等序列，使得DNA疫苗更有效地表达[8]。KOZAK序列是在起始密码子ATG上下游的一串DNA序列，可增强抗原表位多肽的翻译效率，提高表达效率[12]。Th-PADRE为根据主要组织相容性复合物的结合特性而人工合成的，辅助T细胞表位特性的多肽，全长约为13个氨基酸，有助于γ干扰素的高效分泌[16]。CpG1和CpG2作为新型佐剂的一种，属于非特异性免疫增强剂，是核酸疫苗的重要组成部分，具有强大的免疫刺激作用，促进Th1型免疫应答[14]。Th-P18mn是T细胞辅助多肽，无主要组织相容性复合物的限制，可在小鼠体内高效分化半抗原。组织型纤溶酶原激活剂可以促进抗原表位多肽的分泌[15]。 SV40晚期poly(A)加尾信号，对上游的虾过敏抗原表位的表达有一定的调控作用[17]。

表2 盒式片段完整序列

表3 盒式片段重叠PCR所用引物

选用的pCI neo载体属于真核表达载体，有助于将虾过敏的抗原表位多肽在小鼠的动物模型中高效地表达[18]。该DNA疫苗的成功构建，为下一步动物试验提供了很好的试验基础，也为虾过敏的治疗提供了一种新的方法。