胶体金免疫层析法快速检测乳制品中重金属离子铅

赵小旭　柳家鹏　柴艳兵　张耀广　杨敏　滕燕　李曼　郭健

[摘要]本研究建立了快速检测乳制品中重金属离子铅的胶体金免疫层析试纸条分析方法。通过一系列的实验，研究了该方法的灵敏度、重复性和特异性，结果表明用免疫胶体金法测定乳制品中生鲜乳和酸奶的检出限为25～g/kg，成品奶的检出限为30μg/kg，奶粉和奶酪的检出限为300μg/kg，方法重现性较好。使用胶体金免疫层析法和原子吸收光谱法同时检测加标样品，结果一致。该方法适用于乳制品中重金属离子铅的快速检测。

[关键词]铅；胶体金免疫层析法；乳制品

中图分类号：X836 文献标识码：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20180308

铅是对人类健康有巨大毒害作用的金属元素之一，对人体没有任何有益的功能。当人体中铅含量升高时，会破坏血红蛋白的合成，造成贫血、血压增高、肾损伤，造成孕妇流产和堕胎，破坏神经中枢，影响脑发育，影响生育能力，造成小孩发育迟缓和行为冲动。乳品是一种营养成分齐全，含量高并且易被人体吸收的食品，已成为国民摄取营养物质的主要途径之一。随着现代农业的发展，重金属污染日益加重，随食物链进入动、植物体内，使得乳制品受到污染。

目前常见的重金属离子的检测方法主要是石墨炉原子吸收光谱法、原子荧光光谱法、电感耦合等离子体质谱法等，这些方法需要费用高昂的大型仪器设备、专门的实验室、专业的操作技术人员和复杂的样品前处理过程，不适合现场快速筛选检测。

目前也有采用胶体金免疫层析法检测重金属离子铅，但是主要集中于粮食作物，针对乳制品的研究较少。因此本文基于胶体金免疫层析技术检测乳制品中重金属铅的含量具有必要性，并且对于乳品企业来说具有实际意义。

1材料与方法

1.1主要仪器

干式加热器（HMG-GS，北京华安麦科生物技术有限公司）、胶体金读数仪（BMZ6000，北京美正生物科技有限公司）、200μL移液器（赛多利斯（上海）贸易有限公司）、计时器（北京华安麦科生物技术有限公司）、离心管（50mL、20mL，洁特）、枪头（BIOFIL）、一次性手套（麦迪康）、离心机（DM0412，大龙兴创实验仪器（北京）有限公司）、原子吸收光谱仪（PinAAele900T，perkinelmer公司）、涡旋混合器（TZL-5013，苏州珀西瓦尔实验设备有限公司）、分析天平（PL-602E，梅特勒一托利多分析天平）、20目筛网。

1.2主要试剂

三氯甲烷、甲醇、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、EDTA等。

1.3方法

1.3.1检测原理

重金属离子铅定性检测试纸条应用了竞争抑制胶体金免疫层析的原理，结构如图1所示。将金标抗体结合在金标垫/微孔中，将抗原（T线）和二抗（C线）固定于NC膜上，当待测样品加到样品垫/微孔中后，样本中抗原与金标抗体结合，通过层析作用向前移动。当移至T线区域时，偶联抗原和未结合金标抗体结合而被截留，聚集在检测线（T线）上，剩余金标抗体越过检测线（T线），在质控线（c线）处与二抗结合显色。通过可目测的胶体金标记物得到直接的显色结果或者配合仪器判读。

1.3.2检测方法

1.3.2.1样品前处理

（1）生鲜乳：量取生鲜乳10mL，置于50mL离心管中，加入10mL三氯甲烷和1mL甲醇，振荡5min，4 00～min离心5min；移取200μL的PBS溶液（0.01M）和200μL的EDTA（0.5M），置于2mL离心管中，加入40μL上清，振荡均匀，1min内待检。

（2）成品奶、奶粉、酸奶、奶酪样本处理方法。成品奶取样方法：量取10mL成品奶，置于50mL离心管中；奶粉取样方法：称取1g奶粉，置于50mL离心管中，加入9mL纯净水；酸奶取样方法：称取10g酸奶，置于50mL离心管中；奶酪取样方法：奶酪粉碎，称取1g粉碎的奶酪，置于50mL离心管中，加入9mL纯净水，震荡3min。按照上述方法取样后，加入10mL三氯甲烷和1mL甲醇震荡5min，4 000r/min离心5min；移取200μL的PBS溶液（0.01M）和200μL的EDTA（0.5M）于2mL离心管中，加入50μL上清，振荡均匀，1min内待检。

1.3.2.2检测步骤

（1）取所需數量的微孔和试纸条，并做好标记，将微孔置于40%干式加热器上。

（2）用移液器取200μL待检样本加入微孔，并反复吸打，直至红色固体充分混匀进行孵育，计时5min。

（3）将试纸条立即插入微孔中进行反应，计时5min。

（4）取出试纸条，去除下端样品垫进行结果判读，实验完毕后将试纸条放入盒中密封，2℃～8℃保存。

2结果与分析

2.1结果判定

试纸条检测结果的判定分为肉眼判定和读数仪读数判定两种方式，具体的判定方式可根据实际情况进行选择。

2.1.1肉眼判定

胶体金免疫层析法结果判定如图2所示。当T线和C线同时出现红色带时，若T线颜色较C线深或者颜色相同，表示样品中待检物质浓度低于检测限，或不含待检物质，检测结果为阴性；若T线颜色较C线浅或T线未显色，则表示样品中待检物质浓度高于检测限，检测结果为阳性；若c线未显色，检测结果无效，可能是因为操作过程不正确或试纸条已失效。

2.1.2读数仪读数判定

打开样品卡壳，将定量试纸条插入样品卡壳槽内，保证白色NC膜表面的两条色带在卡壳视窗中间。将样品卡壳插入读数仪样品卡槽中，按照仪器操作程序，点击触屏“检测”键或“TEST”按钮，读取结果。当样本不含待测物或低于检测限，检测结果为阴性；当样本所含待检物介于半检测限和检测限之间时，检测结果为疑似阳性；当样本所含待检物高于检测限时检测结果为阳性。

2.2检出限实验

目前市场上乳制品种類繁多，本实验选取生鲜乳、成品奶、奶粉、酸奶和奶酪5类样品进行检出限实验验证。分别取三个批次的重金属离子铅胶体金试纸条进行添加实验，生鲜乳、成品奶、酸奶的添加量为25μg/kg、30μg/kg、35μg/kg。奶粉和奶酪的添加量为200μg/kg、300μg/kg、400μg/kg。上述加标样品重复6次进行检测，结果如表1所示。

由表1可知，生鲜乳和酸奶的检出限为25μg/kg，成品奶的检出限为30μg/kg，奶粉和奶酪的检出限为300μg/kg。由于每个乳制品生产加工的工艺不同，所以样品基质复杂多样，为了保证实验的科学、严谨和准确性，所以需要对每类产品的检出限进行评定，以确定相应样品的检出限。从表1可以看出，不同批次的试纸条检测结果存在一定的差异，所以在进行检出限评定时，选择3个批次的试纸条进行试验，保证实验结果准确。

2.3重复性实验

选取生鲜乳、成品奶、奶粉、酸奶和奶酪分别进行检测本底样品、1倍检出限和2倍检出限加标样品，选取3个批次的产品进行检测，每个样本使用不同批次的试纸条同时检测6次，结果如表2所示。

由表2可知，用3个批次的重金属离子铅检测本底样品时，结果均为阴性，当添加量为1倍检出限和2倍检出限时，检测结果均为阳性。通过检测结果可知，结果一致，产品重复性好。

2.4稳定性实验

选取上述5类样品中的一种代表性样品，分别添加重金属离子铅标准品，制成阳性样品。然后用3个批次的重金属离子铅的胶体金试纸条分别平行检测2次，检测结果均为阳性，对上述样品用相同的方法连续检测7天，检测结果均为阳性，说明重金属离子铅胶体金试纸条日内、日问的稳定性较好，试纸条保存在2℃～8℃，12个月保质期内仍可以特异性检出阳性，并且灵敏度没有降低。

2.5特异性实验

为了检测重金属铅胶体金试纸条对其他重金属离子的识别能力及检测特异性，将常见的重金属离子汞、离子铬、离子铜、离子镉添加到上述5类样品中，与重金属铅胶体金免疫层析试纸条做交叉反应。检测结果显示，重金属铅胶体金试纸条能够清晰地识别铅离子，与其他几种重金属离子没有交叉反应，试纸条的特异性良好。

2.6与仪器法对比实验

胶体金试纸条的检出限与仪器法的检出限存在一定的差异，目前我国食品中重金属的检测方法大部分企业采用GB 5009.12-2017《食品安全国家标准食品中铅的测定》石墨炉原子吸收光谱法（该方法的检出限为0.02mg/kg，定量限为0.04mg/kg检测乳制品中的重金属离子铅。为比对两种测定方法，选择阴性样品和添加量为0.5mg/kg的阳性样本进行检测，这样能够有效地保证在标准之下两种方法均能有效检出，结果如表3所示。

由表3可知，两种方法检测结果一致，表明试纸表3试纸条法和原子吸收光谱法检测结果对比条可用于生鲜乳、成品奶、奶粉、酸奶和奶酪中重金属离子铅的快速筛选检测。

2.7注意事项

为了杜绝检测过程中一些不适宜因素导致检测结果出现异常，需要注意以下几点：（1）不同批次试纸条、微孔、射频卡均不能混用。（2）产品为一次性消耗品，请在有效期内使用。（3）请勿触摸试纸条中央白色膜区。（4）微孔打开时不要用力过猛，以免有粉末飞出，打开后请尽快使用，以免影响检测结果。（5）所检测样本必须为均匀液体，不能有结块、发酵、酸败、沉淀等现象。（6）所有溶液使用前需摇匀，试剂B会有沉淀出现，但不影响结果。（7）溶液移取时请带保护性手套及口罩进行操作。（8）建议一次检测数量不要超过8个，超过8个可分批检测。（9）检测时避免阳光直射和电风扇直吹。（10）请勿用自来水、纯水及蒸馏水做阴性对照。（11）如发现阳性，检测结果需要使用法定的确证方法进行确证。

3结论

通过一系列实验，重金属离子铅胶体金免疫层析试纸条检测时间在15min内，生鲜乳和酸奶的检出限为25μg/kg，成品奶的检出限为30μg/kg，奶粉和奶酪的检出限为300μg，kg。批间重复性和批内重复性良好，检测结果与仪器法检测结果一致。方法简便，对人员专业技能要求相对较低，并且其灵敏度、稳定性和特异性等均达到了食品中污染物快速检测的要求，非常适用于乳品企业前期的筛选工作。