siRNA干扰Notch1诱导肝癌细胞凋亡的机制研究

向利军 贺翊峰 鲁才杰 陈伟强 郭亮 季明芳

〔摘要〕 目的 研究Notch1在肝癌組织及细胞中的表达并初步探讨Notch1下调后诱导肝癌细胞调亡的机制。方法 2016年3月至2016年9月于广东医科大学附属医院肝胆外科收集32例肝癌病人样本，利用qRT-PCR方法检测肝癌癌组织及癌旁组织中Notch1基因的表达，免疫组化检测组织中Notch1蛋白表达，siRNA沉默肝癌细胞Notch1表达，流式细胞术检测细胞凋亡情况，Western blot方法检测Notch1、Bcl2和Bax蛋白表达，统计分析Notch1表达水平与肝癌病人临床诊断指标甲胎蛋白（AFP）的相关性。结果 肝癌组织标本中Notch1高表达率为71.9%（23/32），明显高于癌旁组织的28.1%（9/32），差异具有显著统计学意义（P<0.01）； Pearson相关性分析显示，Notch1与AFP存在正相关性（R2=0.3376，P=0.0036）；免疫组化验证Notch1蛋白分别在肝癌癌组织样本中高表达和癌旁组织中低表达；siRNA干扰Notch1基因表达后，镜下发现肝癌细胞4401增殖抑制，流式检测示转染组明显凋亡，蛋白免疫印迹显示凋亡相关蛋白Bcl2蛋白下调、Bax表达上调。结论 Notch1与肝癌的发生、发展相关，下调Notch1可诱导肝癌细胞凋亡，同时Notch1还可作为临床治疗肝癌的潜在新靶点。

〔关键词〕 Notch1；甲胎蛋白；凋亡；肝癌SiRNA

〔中图分类号〕R735.7 〔文献标志码〕A 〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.03.013

Mechanism of siRNA Targeting Notch1 on Apoptosis in Hepatocellular Carcinoma Cells

XIANG Lijun1，2， HE Yifeng1， LU Caijie1， CHEN Weiqiang3*， GUO Liang4， JI Mingfang5

（1 Postgraduate College of Guangdong Medical University， Zhanjiang， Guangdong 524003， China； 2. Affiliated Hospital of Guangdong Medical University， Zhanjiang， Guangdong 524001， China； 3. Department of Hepatobiliary Surgery， Zhongshan People's Hospital， Zhongshan， Guangdong 528403， China； 4. Affiliated Zhongshan Hospital of Guangdong Medical University， Zhognshan， Guangdong 528415， China； 5. Cancer Institute of Zhongshan， Zhongshan， Guangdong 528403， China.）

〔Abstract〕 Objective To investigate the expression of Notch1 in liver cancer specimens and explain the mechanism of induction of apoptosis by downregulating Notch1 expression. Methods The 32 tissue samples were obtained from Hepatobiliary Surgery of the Affiliated Hospital of Guangdong Medical College during March 2016 to September 2016. The expression of Notch1 gene in hepatocellular carcinoma and adjacent tissues was detected by qRT-PCR. The expression of Notch1 protein was detected by immunohistochemistry. The expression of Notch1， Bcl2 and Bax protein in siRNA was detected by Western blot. The cells were transfected Notch1 siRNA. Apoptosis was detected by flow cytometry. The correlation of Notch 1 expression with the clinical diagnostic index of alpha-fetoprotein （AFP） were revealed by statistical analysis. Results The positive rate of Notch1 in tumor tissues was 71.9% （23/32） and negative rate was 28.1% （9/32）， the difference was statistically significant （P<0.01）. Pearson correlation analysis showed that there was a positive correlation between Notch1 and AFP（R2=0.3376， P=0.0036）. Immunohistochemical results confirmed that Notch1 protein was positive in hepatocellular carcinoma tissues. The data indicated that knockout of Notch1 expression by siRNA would inhibit the proliferation and induce the apoptosis in 4401 cells. In addition， the expression of Bcl2 was attenuated and the expression of Bax was enhanced. Conclusion Notch1 is associated with the development and progression of HCC and the induction of Hepatocellular carcinoma cells apoptosis is driven by down-regulation of Notch1. Notch1 can be used as a potential new target for clinical treatment of hepatocellular carcinoma.

〔Keywords〕 Notch1； alpha fetoprotein； apoptosis； hepatocellular carcinoma； siRNA

肝癌仍是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一，虽然随着科技的发展及治疗手段的进步，肝癌病人的治疗取得一定的进展，但肝癌发生、发展机制仍不明确，而且肝癌高复发，高转移，导致肝癌患者总体预后仍然较差[1-2]。因此，探索肝癌发生、发展的机制及其临床治疗靶点对于肝癌的治疗及提高生存率具有积极的作用。研究发现Notch1与多种肿瘤的发生、发展相关，在乳腺癌、甲状腺癌、直肠癌中均发现Notch1明显高表达[3]。然而Notch1在肝癌发生发展中的作用及是否参与调控肝癌细胞凋亡并未见报道，本实验通过qRT-PCR方法检测肝癌癌组织及癌旁组织中Notch1基因的表达，siRNA沉默Notch1表达后观察对肝癌细胞4401的影响，来探讨Notch1在肝癌发生发展及调控肝癌细胞凋亡机制中的作用。

1 材料与方法

1.1 临床样本

于2016年3月至2016年9月收集32例肝癌标本，肝癌及癌旁组织均取自广东医科大学附属医院肝胆外科手术切除标本，术后病理均为肝细胞肝癌，该实验符合广东医科大学伦理委员会标准且取得病人同意。

1.2 实验材料

Lipo 2000和DEPC 水购于美国Invitrogen公司；Trizol RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒购于大连宝生物工程公司；免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶（SP）试剂盒、二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒购于北京中杉生物技术公司；Annexin V-FITC/碘化丙啶（propidium iodide， PI）细胞凋亡检测试剂盒购于杭州碧云天公司。Notch1（批号：3608S）、Bax（批号：5023S）、Bcl2（批号：3498S）和GAPDH（批号：2118L）多克隆抗体购于Cell Signaling Technology 公司。

1.3 原代细胞培养

人肝癌4401细胞分离于肝癌病人手术后肝癌组织，组织用灭菌手术刀片切切成1 mm见方小块，加含20%胎牛血清和100单位/mL双抗（青霉素 链霉素）的DMEM/F12培养基，置37 ℃ 5% CO2饱和湿度下培养1周，肝癌细胞从原组织块中伸出后生长，去除组块后传代培养，用于后续实验。细胞贴壁长满80%传代，0.25%胰蛋白酶消化，每2～3天传代1次。实验选用对数期生长细胞。

1.4 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测

按照Trizol试剂盒方法提取对应癌与癌旁组织中总RNA，逆转录为cDNA，取2 μL cDNA模板配制PCR反应液上机，所检测Notch1上游为5-CCCGTTCTTGAAATGTAGGCATC-3，下游5-TGTCTTTCCCCAGAAAAGGGTA-3；18 s上游5-CGGCGACGACCCATTCGAAC-3，下游5-GAATCGAACCCTGATTCCCCGTC-3，扩增条件为：95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃后延伸10 s，10 μL体系，40个循环扩增。

1.5 免疫组化以及判定标准

收集手术切除的肝癌及癌旁组织，PBS清洗标本用含10%甲醛的福尔马林固定过夜，每例样本切取1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm大小组织块，经脱水、透明处理后由石蜡包埋，将包埋的组织标本置于切片机上均匀快速并连续的切成2～4 μm左右的切片，展片后置于载玻片1/3～2/3交界处。采用免疫组织化学（SP）染色，经脱蜡、高温热抗原修复、封闭后滴加Notch1一抗（稀釋比例1∶150）后4 ℃孵育过夜，室温孵育二抗1 h，最后由DAB显色，苏木精复染，封片。阳性表达率（%）=（Notch1表达阳性的肿瘤细胞数/所有肿瘤细胞数）×100%，阳性表达率大于10%即为阳性，小于10%为阴性。3个独立观察者分别选取5个高倍镜下独立视野进行诊断。

1.6 Western-blot方法检测蛋白含量

提取细胞总蛋白，加入含1 mol/L PMSF的裂解液200 μL冰上裂解，由4 ℃ 13 000 r/min离心10 min后分别取上清液，蛋白浓度经BCA法测定，经SDS-PAGE （8%分离胶）电泳，转膜至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗膜，二抗常温孵育1 h，TBST洗膜，加入发光液曝光，选取GAPDH蛋白作为内参。

1.7 siRNA转染

实验分为对照组（Control）、脂质体转染组（si-NC）和siRNA转染组（si-N1）。按照Lipo 2 000试剂盒进行转染，采用无双抗培养基培养细胞融合度为90%时进行转染，50 μL OPTI-MEMⅠ稀释0.8 μg DNA，50 μL OPTI-MEMⅠ培养基稀释2 μL Lipo 2 000，稀释的Lipo 2000同稀释的DNA轻轻混合后，将其加入到每孔中，来回摇动培养板，轻轻混匀。在37 ℃ 5% CO2培养24～48 h吸除无双抗培养液，换入正常培养液继续培养。

1.8 流式细胞术

为检测下调Notch1后肝癌细胞凋亡情况，细胞经转染处理后培养24 h，收集细胞并按照Annexin V-FITC/PI试剂盒说明进行染色处理后上机检测细胞凋亡。实验独立进行，重复3次。

1.9 统计学方法

实验所得数据采用SPSS 18.0软件进行统计分析，计量资料采用“x±s”表示， 两样本均数的比较采用t检验，运用皮尔森相关性分析检测参数间的关系，检验水准α取值为0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝癌樣本中Notch1基因的表达及与临床指标AFP的相关性

图1A，1B所示，通过qRT-PCR方法分析同一病人肝癌及癌旁组织中Notch1的表达，发现32例肝癌组织中23例样本Notch1高表达 （71.9%），9例低表达（28.1%），差异具有统计学意义（P<0.01）。同时，图1C所示，Notch1的表达与病人血清AFP含量存在正相关性（R2=0.3376，P=0.0036）。

2.2 肝癌样本中Notch1蛋白的表达

免疫组化检测Notch1蛋白的表达，结果进一步证实Notch1在肝癌组织中被激活（图2）。

2.3 沉默Notch1后诱导肝癌细胞系4401调亡

Notch1转染4401细胞，24 h后镜下（×100）观察肝癌4401细胞发生明显凋亡（图3A）；流式结果示siRNA-N1组细胞明显发生凋亡（图3B，3C）；Western blot检测示Notch1蛋白表达降低，同时抗凋亡蛋白Bcl2表达下调，促凋亡蛋白Bax表达上调（图3D）。

3 讨论

Notch通路与肿瘤的相关性最先是在T细胞急性白血病中确定的[4]。然而，一旦当Notch1表达异常的时候，往往会表现出致癌的特性，譬如在原发性肝癌，胰腺癌中Notch1表达上调并表现出促细胞增殖，抑制细胞凋亡及分化的作用[5-6]。Notch途径由跨膜家族受体（Notch 1-4），其配体（Jagged 1-2，Delta-like 1-3）组成[7]。通过受体与配体的相互作用转导细胞信号，从而在细胞增殖、分化、凋亡、个体生长、发育中发挥重要的调控作用Notch1基因是Notch信号通路中跨膜蛋白受体之一，可与配体结合进入核内并促进相应靶基因激活，从而导致疾病的发生[8]。同时，中国的肝癌病例数和因病死亡数占到了全球范围内的一半上[9]。有荟萃分析证实，在原发性肝癌和胃癌中，Notch1的高表达与肿瘤的的发生有着密不可分的关系[10-11]，同时还预示着病人的预后不良[12]。这些都提示Notch1参与了原发性肝癌的发生和发展。

如qRT-PCR及免疫组化结果所示，在肝癌组织中Notch1基因的表达较癌旁组织明显升高，这进一步证实了Notch1在肝癌中被激活，Notch1可能与肝癌的发生相关。在近期有研究表明，Notch1还可以调节结肠癌肿瘤干细胞从而促使结肠癌的发生，同时还能激活干性基因使肿瘤细胞维持在低分化的状态[13-14]。在临床上，大约80%的肝癌患者血清中的甲胎蛋白含量升高，临床上常将AFP作为诊断原发性肝癌的特异性肿瘤标志物，其对确立诊断、早期诊断、鉴别诊断的具有重要指示作用。在最近的一篇报道中，有人指出乙肝病毒通过刺激AFP的表达诱导肝细胞的重编程，还发现AFP在启动肝癌干细胞进程中起到了重要的作用[15]。本文进一步研究了Notch1和甲胎蛋白（AFP）血清含量之间的关系，结果表明Notch1与AFP具有一定的相关性（R2=0.3376，bP=0.0036）。我们认为过表达Notch1是通过AFP诱导肝癌的发生。本研究还发现沉默Notch1后诱导肝癌细胞系4401调亡。线粒体凋亡通路是常见的细胞凋亡通路，且主要受Bcl-2，Bax蛋白家族调控，Bcl-2是关键的抗凋亡蛋白，Bax是主要的促凋亡蛋白[16]，Bcl-2/Bax的比率能进一步反映了凋亡倾向[17]。Wu等[18-19]发现抑制Notch1表达可抑制肾癌细胞和结肠癌细胞的增殖并诱导其凋亡。所以通过siRNA沉默肝癌细胞中Notch1表达，在镜下发现肝癌细胞可见细胞死亡，通过流式分析证实敲除Notch1的肝癌细胞发生凋亡。蛋白质印迹法结果显示：抗凋亡蛋白Bcl-2被下调，促凋亡蛋白Bax则被上调。这表明Notch1的下调将诱导肝癌细胞的凋亡。 综上可知，本实验证实了Notch1与肝癌的发生、肝癌病人AFP血清含量均具有一定的相关性。敲除Notch1后可以诱导肝癌细胞的凋亡，这也进一步证实了Notch1与肝癌间的关系。然而，Notch1参与肝癌的发生发展、诱导肝癌细胞调亡的具体机制以及能否作为潜在的诊断指标以及治疗肝癌的新靶点还有待于进一步研究。

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