小檗碱体外抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌活性的研究

李玲 卢芳国 陈伶利 向琴 高强 魏科 胡珏 宁毅

〔摘要〕 目的 研究小檗碱体外抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）活性。方法 运用琼脂扩散法、液体稀释法测定并分析小檗碱对MRSA的抑菌环大小、最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）；运用96孔酶标板结晶紫法测定并分析小檗碱对MRSA的最小生物膜清除浓度（MBEC）。结果 与DMSO比较，小檗碱与氯霉素（阳性对照药物）可显著增加MRSA的抑菌环半径（P<0.01），小檗碱对MRSA的MIC为0.2 mg/mL，MBC为0.4 mg/mL；小檗碱对MRSA的MBEC为0.2 mg/mL。结论 小檗碱对MRSA有比较明显的抗菌、抑菌作用，其效应机制可能与其抑制细菌生物膜的形成有关。

〔关键词〕 小檗碱；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；生物膜

〔中图分类号〕R285 〔文献标志码〕A 〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.03.006

Effect of Berberine on the Activity of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus in Vitro

LI Ling， LU Fangguo， CHEN Lingli， XIANG Qin， GAO Qiang， WEI Ke， HU Jue， NING Yi*

（Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To study berberine on the activity of methicillin-resistant Staphylococcus aureus （MRSA） in vitro. Methods The size of antibacterial annulus， minimum inhibitory concentration （MIC） and minimum bactericidal concentration （MBC） of MRSA intervened by berberine were measured by Agar diffusion test and broth dilution test. The crystal violet staining method measured on 96 well Elisa-plate was applied to analyze minimal biofilm eradication concentration （MBEC）. Results Compare with DMSO， berberine and chloramphenicol （positive control drug） could significantly increase the antibacterial annulus radius of MRSA （P<0.01）. The MIC， MBC and MBEC of berberine against MRSA were 0.2 mg/mL， 0.4 mg/mL and 0.2 mg/mL， respectively. Conclusion Berberine shows obvious inhibition effect on MRSA， and its mechanism may be related to the inhibition of bacterial biofilm formation.

〔Keywords〕 berberine； methicillin-resistant Staphylococcus aureus； biofilm

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methieillin-resistant staphylococcus aureus， MRSA）是临床上常见的毒力较强的细菌，是导致坏死性肺炎、坏死性筋膜炎、败血症等感染性疾病的重要病原体[1]。近年来该菌的感染日益增多，严重威胁人类健康。万古霉素是目前临床上确认的治疗MRSA感染的有效药物，但由于万古霉素的滥用，万古霉素对MRSA的最低抑菌浓度（MIC）提高，导致万古霉素疗效欠佳[2]。MRSA一旦发展为对万古霉素普遍耐药，其感染患者将面临无药可治的危险境地。因此，研发与筛选抗MRSA的新型药物刻不容缓。天然植物特别是中草药中蕴含着丰富的天然活性物质，从中筛选抗MRSA药物有良好的应用前景。笔者研究了小檗碱对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌活性影响，本文报道如下。

1 实验材料

1.1 药物与制剂

小檗碱：购自上海源叶生物科技有限公司，规格：20 mg，CAS号：2086-83-1，批号： B21379。实验时用DMSO配制的16 mg/mL小檗碱母液，涡旋仪上振荡直至粉末溶解，用无菌液体培养基稀释小檗碱母液10倍至1.6 mg/mL，即含DMSO浓度为10%。

1.2 菌种及培养基

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）为湖南中医药大学第一附属医院检验科分离与鉴定的临床耐药株，湖南中医药大学病原免疫实验室保存。菌种经活化、鉴定后取对数生长期菌液进行实验。实验用的菌液浓度为1.5×108 cfu/mL。菌种的活化与培养用肉汤培养基及普琼脂培养基培养。

2 方法

2.1 抗菌活性的测定

2.1.1 抑菌环大小的测定 运用琼脂扩散法测定，具体操作如下：取直径12 cm平皿，倾入培养基10 mL，冷凝后用灭菌的棉拭子蘸取供试菌菌液均匀涂布在培养基表面，室温干放置2～3 min。将直径6 mm的无菌牛津杯置琼脂平皿上，于杯中加浓度为1.6 mg/mL的小檗碱50 μL（即80 μg/杯），每种药液设3个重复对照。37 ℃培养24 h后取出，测抑菌环直径，并求出每种药液3个孔抑菌环半径的平均值。同步设阳性药物对照和阴性药物。阳性药物为氯霉素：30 μg/片（药敏纸片法），阴性药物为10%DMSO，加50 μl/孔。

2.1.2 最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）的测定[3] 运用液体稀释法测定，具体操作如下：在96孔细胞培养板中，用液体培养基等倍稀释小檗碱药液（浓度为0.8 mg/mL～0.0125 mg/mL），每孔加稀释小檗碱药液100 μL，每孔加10 μL供试菌液，37 ℃培养24 h后，以MTT法检测各孔600 nm波长下吸光度值。同步设培养基对照孔、菌液对照孔、药液对照孔。在培养基对照孔无菌生长和菌液对照孔有菌生长的情况下，分析判断实验孔结果。以完全无细菌生长（OD值=0）的最低浓度作为药物对该菌的最低杀菌浓度（minimum bactericidal concentration，MBC），以OD值突然升高前的临界值为药物最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）。考虑到药物本身有颜色，实验结果的OD值为去掉药物本底OD值后的余值。

2.2 最小生物膜清除浓度（MBEC）的测定[4]

运用96孔酶标板结晶紫法测定，具体操作如下：在96孔细胞培养板中，用液体培养基等倍稀释小檗碱药液（稀释浓度为0.8 mg/mL～0.025 mg/mL），每孔先加稀释小檗碱药液100 μL，再加10 μL供试菌液，37 ℃培养24 h后，去掉孔内菌液，用生理盐水洗3次培养板，并于每孔加入1%的结晶紫100 μL，室温孵育1 min，再加入30%的乙酸脱色5 min，于595 nm波长下测吸光度值。同步设培养基对照孔、菌液对照孔。在培养基对照孔无生物膜形成和菌液对照孔有生物膜形成的情况下，分析判断实验孔结果。以OD值突然升高前的临界值为药物最小生物膜清除浓度（minimum biofilm eradication concentration，MBEC）。

3 结果

3.1 抗菌活性的测定结果

如图1、图2所示：与DMSO比较，小檗碱与氯霉素（阳性对照药物）可显著增加MRSA的抑菌环半径（P<0.01）。小檗碱对MRSA的MIC为0.2 mg/mL；MBC为0.4 mg/mL。表明小檗碱对MRSA有比较明显的抗菌、抑菌作用。

3.2 最小生物膜清除浓度（MBEC）的测定结果

如图3所示：小檗碱对MRSA的MBEC为0.2 mg/

mL，表明小檗碱对MRSA生物膜的形成有比较明显的抑制作用。

4 讨论

小檗碱（berberine）是一种具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、降压、降糖[5]等药理作用的异喹啉生物碱，又称黄连素，主要存在于小檗属与黄连属植物中，可从黄连、黄柏、三颗针等植物中提取。该药对多种革兰阳性菌（例如：溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎球菌等）、革兰阴性菌（例如：痢疾杆菌、伤寒杆菌，脑膜炎球菌等）、抗酸杆菌（例如：结核分枝杆菌）、真菌（例如：白假丝酵母菌）具抑菌作用，广泛用于胃肠炎、细菌性痢疾等治疗，对肺结核、猩红热、急性扁桃腺炎和呼吸道感染也有一定疗效。分析已有文件报道，笔者认为小檗碱的抑菌抗炎机制可能与下列因素有关[6-8]：（1）小檗碱能够增强白细胞及肝网状内皮系统的吞噬功能，提高机体的抗菌能力；（2）小檗碱通过COX-1或结合型前列腺系E2合成酶-1（mPGES-1）的途径影响PGE2 的生成，降低急性炎症组织中PGE2 含量，提高机体抗炎作用；（3）小檗碱下调组织炎性因子TNF-α与COX-2的表达，改善组织病理变化与超微结构；（4）小檗碱抑制细菌、真菌等生物膜的形成，提高细胞膜的通透性及菌体对药物的敏感性，改善机体抗菌作用。本研究结果表明：小檗碱对MRSA有明显的抑菌与杀菌作用。

生物膜（biofilm）也称生物被膜，是指附着于有生命或无生命物体表面、被细菌胞外大分子包裹的有组织的细菌群体。其形成包括菌体起始粘附、生物膜发展和成熟擴散等阶段。生物膜中存在各种生物大分子物质（例如：蛋白质、多糖、DNA、RNA、肽聚糖、磷脂等）。由于生物膜的屏障作用，生物膜内的细菌、真菌对临床常用抗生素的敏感性显著下降，生物膜内的菌体比浮游菌更加耐药。寻求抗生物膜的药物对耐药性细菌感染的防治更为重要。目前检测生物膜的常用方法主要有96孔酶标板结晶紫法、显微镜观察法和直接观测法三种。96孔酶标板结晶紫法用于观察静置培养的细菌菌膜，是目前测量菌膜生成量最常用的方法。该方法的检测原理是生物膜中的多糖与结晶紫结合而着色[9]。因此，通过测量乙酸脱色洗脱的生物膜的OD值来直接确定菌膜的形成量。本研究结果表明：小檗碱对MRSA生物膜形成有明显的抑制作用，而且小檗碱对MRSA的MBEC与MIC均为0.2 mg/mL。

中药的抗菌、抑菌机制复杂，小檗碱对MRSA的抗菌、抑菌作用可能与其抑制细菌生物膜的形成有关，但其影响生物膜形成的机制是什么？靶点又有哪些？有待进一步研究。

参考文献：

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