紫外分光光度法测定黑曲霉发酵液中糠醛的含量

邱勇 赵姗 黄婕 代园凤 杨莉琴 陈雪 黄杰 李祝

摘要：本文建立了一種利用紫外分光光度法测定黑曲霉（Aspergillusniger）发酵液中糠醛含量的方法。首先对糠醛标准溶液全波长扫描，确定糠醛最大吸收波长，并作为糠醛含量的测定波长。测量糠醛工作液吸光度，绘制糠醛浓度与吸光度关系的标准曲线。制备黑曲霉发酵液，用50%乙醇将发酵母液稀释10倍，测定波长下测定吸光度，参照标准曲线计算发酵液中糠醛的含量。结果表明糠醛的最大吸收波长为276nm，即为测定波长;糠醛标准曲线线性回归方程：y=0.164x+0.001，R2=0.999，测定范围内线性良好;发酵液糠醛含量30.0244 μg/ml;精密度RSD值为0.315%，仪器精密度良好;稳定性RSD值0.450%，待测样品在120 min内稳定;重现性RSD值0.828%，试验方法具有良好重现性;回收率为99.12%～100.35%，其RSD值0.617%。本方法操作易掌握、测定快速、稳定性好且仪器设备成本较低，有利于基础研究和推广。为今后研究黑曲霉其他次生代谢物含量提供了一定方法和数据的参考。

关键词：黑曲霉;糠醛;紫外分光光度法

Determination of Furfural in Aspergillusniger Fermentation Broth by UltravioletSpectrophotometry

QIU Yong1，2，ZHAO Shan1，HUANG Jie1，DAI Yuan feng2，YANG Li qin1，CHEN Xue2，HUANG Jie1，LI Zhu1，2*

（1.College of Life Sciences， Guizhou University， Guiyang， Guizhou 550025， China;2.Bijie Subsidiary in Guizhou Tobacco Company， Bijie， Guizhou 551700， China）

Abstract：A method for determination of furfural content in the fermentation broth of Aspergillusniger van Tieghem （Fungi： Eurotiales：Trichocomaceae）was developed by ultraviolet （UV） spectrophotometry. The maximum absorption wavelength of furfural was first determined by the full-wavelength scan of furfural standard solution， and then used as measurement wavelength of furfural content. The absorbance of furfural working broth was measured and the standard curve of the relationship between furfural concentration and absorbance was drawn. The fermentation broth of Aspergillusniger was prepared. The mother broth of fermentation was diluted 10 times with 50% ethanol. The absorbance was determined at the measurement wavelength. The furfural content in the fermentation broth was calculated with reference to the standard curve. The results show that the maximum absorption wavelength of furfural is 276nm， which is the measurement wavelength. The linear regression equation of furfural standard curve is： y = 0.164x + 0.001， R squared = 0.999， and the linearity within the measurement rangeis good. The content of furfural in fermentation broth is 0.0244 g/ml. The precision RSD value is 0.315%， and the precision of the instrument is good. The stability RSD value was 0.450%， and the samples under test were stable within 120 min. Reproducibility RSD was 0.828%， and the test method had good reproducibility. The recovery rate is 99.12%-100.35%， and its RSD value is 0.617%. This method is easy to grasp， fast in measurement， good in stability and low in cost of equipment， which is conducive to basic research and promotion. It provides a reference for some methods and data for the further study on the content of other secondary metabolites of Aspergillusniger.

Key words：Aspergillusniger;furfural;ultraviolet spectrophotometry

糠醛（furfural）又称呋喃甲醛或麸醛[1]，主要是由戊聚糖分解或酵母发酵所产生，具有一定的毒性[2]，是一种重要的杂环类有机化合物[3]。糠醛可作为生产衍生物（如呋喃、甲基呋喃、四氢呋喃、呋喃酸、糠醇等）的起始原料[4];作为萃取剂用于润滑油、柴油和植物油的精制[5];作为杀虫剂[6]等。随着世界范围内能源危机和环境问题的日益严峻，各化工领域对糠醛的需求量将会持续增长[7]，糠醛应用前景广阔。

黑曲霉在分类学上属于曲霉菌属半知菌亚门，是发酵工业上的重要菌种[8]。黑曲霉可生产功能性酶（酸性蛋白酶、纤维素酶等）、活性物质（柠檬酸、甲壳素）;在饲料生产、环保和医药[9]也应用广泛。目前无黑曲霉独立产糠醛的相关报道，利用黑曲霉发酵生产糠醛丰富了糠醛制备渠道。

糠醛的测定方法主要有化学法[10-11]、HPLC[12-13] 、紫外分光光度法[14-16]。化学法的干扰严重，被测组分要求纯度较高，精确度较低;HPLC法样本处理及测定过程繁琐复杂且成本较高，不适用于长期而频繁的测定;紫外分光光度法具有操作易掌握、测定快速，且酒体中共存组份对紫外吸收光谱测定不产生干扰。本实验采用紫外分光光度法测定黑曲霉发酵液中糠醛的含量，为今后研究黑曲霉其他次生代谢物含量提供了一定方法和数据的参考。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种

黑曲霉（Aspergillusniger）xj：中国典型培养物保藏中心保存，CCTCC No：M206021。

1.1.2试剂

糠醛（≥99.9%）：德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司;无水乙醇（分析纯）：天津市富宇精细化工有限公司;葡萄糖（分析纯）：天津市优谱化学试剂有限公司。

1.1.3仪器与设备

BIOMATE 3S紫外分光光度计：赛默飞世尔科技有限公司;UV-8000紫外可见分光光度计：上海元析仪器有限公司;华普达THZ-82恒温振荡器：常州华普达有限公司。

1.2试验方法

1.2.1孢子悬液的制备

活化黑曲霉菌株，接种于马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）固体斜面培养基上，于26℃恒温培养箱中静置培养5天。制备0.1%（V/V）吐温-80孢子悬浮液。参照袁洪威等人[17]用分光光度法测定黑曲霉孢子浓度的方法。计算得孢子悬浮液孢子量：6.67×106 个/mL。

1.2.2糠醛全波长扫描与标准曲线绘制

糠醛全波长扫描：精密吸取25 μl糠醛（99.9%）标准品，用50%乙醇定容，得到浓度为575 μg/mL糠醛贮备液。转移1 mL贮备液用 50%乙醇定容，得到浓度为11.5 μg/mL糠醛标准溶液。分别取标准溶液3、4、5、6、7 mL糠醛标准溶液至10 mL容量瓶，50%乙醇定容，用50%乙醇作为空白对照，在紫外分光光度计上进行糠醛全波长扫描。

标准曲线绘制：精密吸取 11.5 μg/mL的糠醛标准溶液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分别置于10 mL 容量瓶中，用50%乙醇定容，摇匀，得到浓度依次为1.15、2.30、3.45、4.60、5.75 μg/mL的待测液。以 50%乙醇为空白对照，在 276 nm 处测定吸光度。

1.2.3黑曲霉发酵液中糠醛含量测定

吸取0.5 mL孢子数量为6.67×109孢子悬液接种于马铃薯葡萄糖琼脂液体培养基中，培养5天，条件为150 r/min、26℃。过滤分离得到发酵母液，加入等量无水乙醇，静置5 min，10000 r/min离心10 min沉淀絮状变性蛋白，吸取上清液，再次加入50%乙醇，得到原发酵液稀释10倍的样品。连续制定5份发酵液样品，在波长276 nm处测定吸光度，得到结果参照标准曲线计算发酵液中糠醛的含量。

1.2.4精密度试验

制备同一发酵液样品5份，测定波长下连续测定5次，计算吸光度相对标准偏差。

1.2.5稳定性试验

分别于0、30、60、90、120 min测定发酵液样品的吸光度，分析稳定性。

1.2.6重复性试验

平行处理同一批发酵液，制备5份发酵液样品，分析重复性。

1.2.7回收率试验

向糠醛标准品稀释液中添加三个浓度水平的发酵液（各浓度平行3次），制备9份待测样品溶液，测定吸光度，计算回收率。

2结果与分析

2.1糠醛最大吸收波长的确定

糠醛梯度扫描结果表明，糠醛在276 nm处有最大吸收峰，无杂峰，因此276 nm作为糠醛的测定波长，如图1所示。

2.2糠醛标准曲线的绘制

经测量得到吸光度与所对应溶液浓度如表1。以糠醛浓度（x，μg/mL）为横坐标，溶液吸光度（y）为纵坐标作图，得到糠醛的标准曲线，结果如图2。对数据进行线性回归分析得到回归方程：y=0.164x+0.001（R2= 0.999），浓度在1～6 μg/mL范围内线性良好，满足测试要求。

2.3黑曲霉发酵液中糠醛含量测定

根据测定结果，参照标准曲线计算出稀释糠醛含量和发酵液糠醛含量，如表2。发酵液糠醛平均含量为30.0244 μg/mL。

2.4精密度试验

吸光度与所对应发酵液中糠醛浓度（表3）。经统计分析得到吸光度的RSD（相對标准偏差）值为0.315%，此结果表明测量仪器精密度高。

2.5稳定性试验

不同时间样品吸光度与发酵液中糠醛浓度（表4）。吸光度的RSD值为0.450%，说明待测样品在120min内是稳定的。

2.6重现性试验

平行处理同一批发酵液，制备5份发酵液样品，测定糠醛含量（表5）。吸光度的RSD值为0.828%，表明实验结果和方法的重现性较高。

2.7加样回收率

浓度为1.15 μg/mL的糠醛标准品稀释液与三个浓度水平为1.841 μg/mL、2.549 μg/mL、3.579 μg/mL发酵液混合。测定吸光度，并计算每个水平的RSD值（结果见表6）。试验样品的回收率均在99.12%～100.35%之间，RSD值为0.617%，表明该样品的回收率较高。

3结论与讨论

本文建立了一种利用紫外分光光度法测定黑曲霉发酵液中糠醛含量的方法。糠醛标准溶液作全波长扫描，确定糠醛最大吸收波长是276 nm。梯度稀释糠醛标准溶液，测定吸光度，分析得到线性回归方程：y = 0.164x + 0.001，R2= 0.999，测定范围内线性良好。该方法测定黑曲霉发酵液中糠醛平均浓度为30.0244 μg/mL，回收率为99.12%～100.35%，回收率较高，仪器精密度良好，RSD值为0.315%。张素[18]等人建立了检测黑曲霉菌丝体中糠醛含量的分析方法，得到黑曲霉菌丝体中糠醛含量为1.872 mg/kg。本实验结果表明黑曲霉发酵液中糠醛含量比菌丝体中要高。在一定程度上提高糠醛的获得率。本方法操作易掌握、测定快速、稳定性好、仪器设备成本较低，为今后研究黑曲霉其他次生代谢物含量提供了一定方法和数据的参考。

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