紫外分光光度法快速测定龙泉破壁灵芝孢子粉三萜含量

叶银鹏+叶伟平+周虎+饶璐珊

摘要：选取5种龙泉破壁灵芝孢子粉为研究对象，使用紫外分光光度法，建立了一种快速、简单、高灵敏度，专门针对灵芝孢子粉中三萜测定的方法。结果表明，该方法测得龙泉破壁灵芝孢子粉三萜含量为2.94%～3.43%。熊果酸浓度在20～140 μg范围内呈良好的线性关系，精密度（RSD）为0.88%，回收率为88.6%～92.5%，完全能够满足于破壁灵芝孢子粉中三萜成分的分析研究。

关键词：紫外分光光度法；灵芝孢子粉；三萜；龙泉市

中图分类号：R932 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）02-0329-02

灵芝[Ganoderma lucidum（Leyss. ex Fr.） Karst.]是担子菌纲多孔科灵芝属真菌，具有极高的药用价值。灵芝生长成熟后从菌盖弹射出非常小的孢子即灵芝孢子，灵芝孢子聚集在一起即成为灵芝孢子粉[1-3]。灵芝孢子粉富含三萜、蛋白质和氨基酸、多糖等有效成分，其中具有抗肿瘤、抗HIV-1型病毒、护肝、解毒和改善记忆力等药理活性的三萜更是广泛受到人们的关注[4]。龙泉野生灵芝资源丰富，是天然的“灵芝菌种库”，素有“中华灵芝第一乡”的美誉。2011年，龙泉灵芝孢子粉被国家质检总局批准为地理标志保护产品。因此，快速测定龙泉灵芝孢子粉中三萜含量，对其原产地品质鉴定以及有效活性分析具有重要意义。目前，灵芝孢子粉三萜的检测尚没有统一国家标准，仅能参照农业部在2001年颁布的检测灵芝及其产品中总三萜含量的备案标准（NY/SJ 339-2001）进行。由于该方法不是专门针对灵芝孢子粉三萜含量的检测标准，存在标准取样体积过少，造成标准曲线不准等缺陷。

本研究利用紫外分光光度法，以乙酸乙酯为提取剂，采用热超声提取技术，对龙泉破壁灵芝孢子粉的三萜含量进行检测，同时建立了一种专门针对灵芝孢子粉三萜含量的快速、简单的检测方法，对于灵芝孢子粉生产企业具有较好的应用意义。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

熊果酸标准品（GR，99%）、香草醛（AR，99%）、乙酸乙酯（AR，99%）購自上海麦恪林生化科技有限公司；冰醋酸（CH3COOH，GR）购自丽水宏大化学用料有限公司；水为超纯水，由ULUP-Ⅳ-20T超纯水仪制备，电阻率>18.25 MΩ·cm。

1.2 仪器

UV-8000紫外分光光度计（上海元析仪器有限公司）；AL104电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；SK8210HP超声波清洗器（上海科导超声波仪器有限公司）；HH-4数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）；THD-0506低温恒温槽（宁波天恒仪器厂）。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液配制 精密称取熊果酸标准品10 mg，用乙酸乙酯定容于50 mL容量瓶中，即得200 mg/L熊果酸标准品溶液。

1.3.2 样品处理 精密称取灵芝孢子粉0.5 g（精确到0.000 1 g）放入50 mL的离心管中，加入20 mL乙酸乙酯，放入超声波清洗器中超声30 min，超声功率为53 kHz，温度60 ℃。超声结束后，将上层清液过滤至50 mL的容量瓶中，再加入20 mL乙酸乙酯到沉淀物中重复上述操作，合并2次上清液，定容至50 mL容量瓶，即得样品提取液。

1.3.3 样品测定 取0.3 mL提取液于60 ℃水浴蒸干，然后加入0.40 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液和 1.00 mL高氯酸，在60 ℃水浴加热15 min并移入冰水浴中；再加入5.00 mL冰乙酸，摇匀后置于室温；15 min后在548 nm波长下测定样品溶液的吸光度。精密吸取熊果酸标准对照溶液0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mL，按上述优选条件及步骤在548 nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，熊果酸含量为横坐标，绘制标准曲线，得到回归方程，考察熊果酸在相关浓度范围内的线性关系。

1.3.4 计算 破壁灵芝孢子粉中三萜含量测定应用标准曲线方法计算，样品中的三萜含量（X）以质量分数表示，如下式所示：

X=（50/0.3）C/1 000·m×100%

式中，m为试样灵芝孢子粉样品质量（g）；C为提取液中三萜浓度（mg）；X为灵芝孢子粉三萜含量（%）。

2 结果与分析

2.1 线性方程

按“1.3.3”条件精确吸取相应体积数的熊果酸标准工作液在进行测定，根据吸光度与浓度进行回归分析，考察三萜在相关浓度范围内线性关系。以吸光度为纵坐标，质量为横坐标作标准曲线（如图1所示），回归方程y=0.007 26x-0.051 29，r=0.999 79，表示吸光度与熊果酸含量在20～140 μg围内呈良好的线性关系。在548 nm处的方法检出限为3.9 μg。

2.2 灵芝孢子粉三萜含量测定分析

从市场购买5种不同品牌产自龙泉的破壁灵芝孢子粉样品。样品处理根据上述提取方法和检测方法进行，检测结果如表1所示。从表1中可看出，两次独立测试结果的绝对差值小于10%。5种来自龙泉的破壁灵芝孢子粉的三萜含量为2.94%～3.43%，不同厂家的龙泉灵芝孢子粉三萜含量差别不大。表明龙泉产区的破壁灵芝孢子粉的三萜含量相对稳定。

2.3 精密度试验

为了考察该方法的精密度，进行精密度试验。取1#样品提取液5份，每份0.3 mL，按上述检测方法检测三萜含量。连续进样5次测定吸光度，并计算每种样品的相对标准偏差（RSD），结果见表2。从表2可以看出，该方法的RSD为0.88%，精密度良好。

2.4 加标试验

为了验证该方法的可行性，进行加标试验。配制100 mg/mL的熊果酸溶液，作为加标试验用。取样品0.5 g，放入50 mL比色管。取0.5 mL浓度为100 mg/mL的熊果酸溶液，加入上述比色管中。样品前处理以及检测过程分别按“1.3.2”和“1.3.3”进行，结果如表3所示，该方法检测灵芝孢子粉的回收率为88.6%～92.5%，表明该方法应用于灵芝孢子粉三萜的提取是可行的。

3 结论与讨论

本研究以龙泉灵芝孢子粉为研究对象，选用低毒的乙酸乙酯为提取液，利用紫外分光光度法快速测定三萜含量，样品处理仅通过恒温超声后进行UV分析，简单高效。本研究建立的快速、简单、高灵敏度、环保的紫外分光光度法专门针对破壁灵芝孢子粉三萜含量检测，并且针对线性、精密度、回收率等进行了方法验证。结果表明，该方法测得龙泉灵芝孢子粉三萜含量为2.94%～3.43%。熊果酸标准品在20～140 μg范围内呈良好的线性关系，精密度（RSD）为0.88%，回收率为88.6%～92.5%。并且该方法所用的仪器设备简单，提取溶剂经济环保，提取技术简单高效，尤其适合应用于灵芝孢子粉企业内部检测。

参考文献：

[1] 林志彬，王鹏云.灵芝孢子及其活性成分的药理研究[J].北京大学学报（医学版），2006，38（5）：541-547.

[2] 唐 柳，张志军，魏雪生，等.灵芝孢子粉药理作用研究进展[J].天津农业科学，2011，17（3）：25-28.

[3] 严培兰.破壁时间对灵芝孢子粉中有效成分测定的影响[J].上海农业学报，2014，30（3）：42-44.

[4] 董虹玲，夏广萍，赵娜夏，等.HPLC法测定灵芝子实体和孢子粉中灵芝酸C2、灵芝酸G和灵芝酸A[J].现代药物与临床，2013， 28（1）：41-43.