酶法提取鲍鱼内脏多糖工艺的优化

陈胜军 刘先进 杨贤庆 李来好 黄卉 李春生

摘要：【目的】优化鲍鱼内脏多糖酶解工艺条件，为鲍鱼内脏多糖的提取和高值化利用提供技术支持。【方法】以杂交鲍内脏为原料、多糖提取率为评价指标，从6种蛋白酶中筛选出提取鲍鱼内脏多糖的适宜酶制剂，并在单因素试验的基础上，利用响应面法对多糖提取率影响较大的蛋白酶作用条件进行优化，依据回归分析确定其最适作用条件。【结果】胰蛋白酶是提取鲍鱼内脏多糖的适宜酶制剂；各因素对鲍鱼内脏多糖提取率的影响排序为料液比>pH>加酶量，料液比与pH的交互作用对多糖提取率影响显著（P<0.05），而料液比与加酶量、pH与加酶量的交互作用对多糖提取率影响不显著（P>0.05）。胰蛋白酶提取鲍鱼内脏多糖的最适工艺条件为：料液比1∶49（g/mL）、pH 8.6、加酶量2.1%、酶解时间2 h、酶解温度37 ℃，在此条件下，鲍鱼内脏多糖提取率为6.97%，与预测值（6.99%）接近。【结论】通过响应面试验优化的胰蛋白酶酶解工艺可有效提取鲍鱼内脏多糖，建立的回归模型可用于实际生产预测。

关键词： 鲍鱼；内脏；酶解法；多糖提取率；响应面分析

中图分类号： S986.2 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）07-1389-07

0 引言

【研究意义】多糖、蛋白质与核酸并称为三大生命物质（蔡孟深和李中军，2007），其中多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂等作用（Zhu et al.，2010a，2010b；Li et al.，2011；邹文文，2013；Wang et al.，2014），在功能食品和临床医学上被广泛应用。我国是世界第一养鲍大国，养殖产量从2006年的2.16万t快速增长至2016年的13.97万t，近十年来的年均增长率达54.68%（农业部渔业渔政管理局，2017）。鲍鱼内脏占总体质量的20%左右，有很大的开发利用空间，但目前我国对鲍鱼加工副产物尚未充分利用，不仅造成原材料浪费，还易引起环境污染。因此，研究鲍鱼内脏多糖的提取工艺，对提高鲍鱼资源综合利用率和鲍鱼加工产品的附加值具有重要意义。【前人研究进展】在鲍鱼多糖的组成和活性功能方面，吴耀文等（2002）对杂色鲍中分离出的一种硫酸酯多糖组成进行研究，结果发现其主要由半乳糖、葡萄糖和少量木糖、岩藻糖、葡萄糖醛酸组成；刘春燕（2011）通过试验发现鲍鱼内脏多糖具有免疫活性；罗晓航（2012）研究发现鲍鱼内脏粗多糖可能具有抗氧化能力。在鲍鱼多糖提取方面，殷红玲等（2006）通过正交试验对酶法提取鲍鱼肉中多糖的工艺进行优化，结果表明，木瓜蛋白酶的适宜反应条件为温度55 ℃、时间2 h、pH 8.0、料液比1∶40、加酶量2.0%，在此條件下多糖提取率为19.60%；余鑫（2012）研究鲍鱼内脏粗多糖提取工艺，得到最佳工艺条件为酶解时间2.5 h、料液比1∶6、加酶量2.4×104 U/g、酶解温度55 ℃；Xu等（2016）通过酶水解、阴阳离子交换树脂等方法提取出鲍鱼内脏多糖，结果表明这些方法均具有可行性，所得内脏多糖纯度较高。【本研究切入点】目前，利用响应面法优化鲍鱼内脏多糖提取工艺的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】通过单因素试验和响应面试验优化鲍鱼内脏酶解工艺，以获得最适的酶解工艺条件，为鲍鱼内脏多糖的提取和高值化利用提供技术支持。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

杂交鲍内脏取自福建连江产杂交鲍，经组织捣碎机捣碎混匀制成样品，于-20 ℃冷冻保藏。碱性蛋白酶（580000 U/g）和中性蛋白酶（100 U/mg）购自广州柏棠贸易有限公司，Alcalase蛋白酶（2.4 AU/g）、胃蛋白酶（10000 U/mg）、胰蛋白酶（250 U/mg）和木瓜蛋白酶（800 U/mg）购自广州齐云生物技术有限公司，盐酸、氢氧化钠、葡萄糖、苯酚、浓硫酸等均为国产分析纯。主要仪器设备：Sunrise-basic Tacan吸光酶标仪（瑞士Tecan公司）、TDZ5-WS台式低速离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）、LFP-800T莱芙粉碎机（永康红太阳机电有限公司）、Alpha 1-4冷冻干燥机（德国Marin Christ公司）。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 鲍鱼内脏多糖提取工艺流程 鲍鱼内脏→冻干→粉碎过40目筛→鲍鱼内脏粉→调节料液比→调节pH→酶解预定时间→沸水灭酶10 min→冷却，调中性→离心（4500 r/min）10 min→加上清液3倍体积的95%乙醇→醇沉过夜→离心→测多糖提取率。

1. 2. 2 最佳用酶选择 蛋白酶由于来源及其酶切位点不同，因此对生物的酶解效果有所差异（黄小葳，2011）。利用不同种类的蛋白酶对鲍鱼内脏进行酶解，酶解条件见表1，按照1.2.1方法提取分离得到多糖，以多糖提取率为评价指标，选择最佳蛋白酶。

1. 2. 3 胰蛋白酶的单因素试验 根据最佳用酶的试验结果，选用胰蛋白酶作为酶解蛋白酶，准确称取一定量的鲍鱼内脏粉，以料液比、pH、酶解时间、酶解温度和加酶量为可变因素，采用1.2.1方法提取多糖，并测定多糖含量。

1. 2. 4 鲍鱼内脏多糖酶解工艺的响应面优化 在单因素试验的基础上，通过SPSS 20.0进行方差分析，选择对多糖提取率有显著影响的3个因素（料液比、pH和加酶量），根据Box-Benhnken中心组合试验设计原理（赵志霞等，2017），以多糖提取率为评价指标进行响应面试验，进一步优化鲍鱼内脏酶解工艺。响应面因素水平设计如表2所示。

1. 3 多糖含量测定

采用苯酚—硫酸法测定鲍鱼内脏多糖含量（程婷婷等，2008）。

多糖提取率（%）=提取物中多糖含量（g）/原料干品质量（g）×100

1. 4 统计分析

采用SPSS 20.0进行差异显著性分析，Design Expert 8.0.6对试验数据进行回归分析。

2 结果与分析

2. 1 最佳用酶筛选结果

由图1可知，采用胰蛋白酶酶解鲍鱼内脏的多糖提取率最高，可达3.56%，而胃蛋白酶多糖提取率最低，仅有2.09%。影响提取率最重要的因素是酶的种类及提取工艺条件，不同蛋白酶在其底物的酶切位点不同，其具有专一性。由于酶具有专一性即只对某一特定蛋白结构进行酶切，而动物多糖大多与蛋白相连，因此为了提取多糖，必须将蛋白与多糖分离开，故酶的专一性越差多糖提取率就越高。从试验结果来看，选择胰蛋白酶为最佳水解酶进行后续试验。

2. 2 单因素试验结果

2. 2. 1 料液比对鲍鱼内脏多糖提取率的影响 在酶解温度37 ℃、pH 8.0、酶解时间3 h、加酶量2.0%的条件下，考察料液比（1∶20、1∶30、1∶40、1∶50和1∶60）对酶法提取鲍鱼内脏多糖效果的影响。由图2可看出，料液比从1∶20到1∶50递变时，鲍鱼内脏多糖提取率逐渐增加，在1∶50时达最大值（6.46%），料液比从1∶50到1∶60递变时，多糖提取率逐渐降低。料液比1∶40、1∶50和1∶60间的多糖提取率无显著差异（P>0.05，下同），但与1∶20存在显著差异（P<0.05，下同）。料液比太大或太小均会对多糖提取造成负面影响，比值太大时，体系黏度过大，流动性较差，不利于底物与酶的充分反应，从而对酶促反应产生一定的抑制作用；比值太小时，底物浓度和酶浓度都会被稀释，造成酶与底物接触的几率降低，也不利于多糖提取（李静等，2014）。综合考虑，胰蛋白酶提取鲍鱼内脏多糖的适宜料液比为1∶50。

2. 2. 2 pH对鲍鱼内脏多糖提取率的影响 在酶解温度37 ℃、料液比1∶40、酶解时间3 h、加酶量2.0%的條件下，考察pH（7.0、7.5、8.0、8.5和9.0）对酶法提取鲍鱼内脏多糖效果的影响。由图3可看出，pH从7.0到8.5递变时，多糖提取率逐渐增加，pH 8.5时达最大值（6.94%），pH从8.5到9.0递变时，多糖提取率逐渐降低。pH在8.0、8.5和9.0时，多糖提取率间无显著差异，但三者与pH 7.0和7.5的多糖提取率存在显著差异。在酶催化过程中，pH通过影响酶活性，从而影响酶的催化速率（程婷婷等，2008）。综合考虑，胰蛋白酶提取鲍鱼内脏多糖的最适pH为8.5。

2. 2. 3 酶解时间对鲍鱼内脏多糖提取率的影响 在酶解温度37 ℃、料液比1∶40、pH 8.0、加酶量2.0%的条件下，考察酶解时间（1、2、3、4和5 h）对酶法提取鲍鱼内脏多糖效果的影响。由图4可看出，酶解时间1～5 h的多糖提取率间无显著差异；酶解时间由1 h延长至2 h时，多糖提取率逐渐增加，酶解2 h后多糖提取率反而下降。可能是由于酶解反应2 h时多糖已最大程度溶出，随着酶解时间的延长，某些小分子量的多糖附着在大分子蛋白上，在醇沉过程中被除去，同时，酶解时间过长，酶解液易变质，导致多糖提取率下降。因此，确定2 h是最佳酶解时间。

2. 2. 4 酶解温度对鲍鱼内脏多糖提取率的影响 在酶解时间3 h、料液比1∶40、pH 8.0、加酶量2.0%的条件下，考察酶解温度（27、32、37、42和47 ℃）对酶法提取鲍鱼内脏多糖效果的影响。由图5可看出，酶解温度为27～47 ℃的多糖提取率间无显著差异；酶解温度由27 ℃升至37 ℃时，多糖提取率逐渐增加，在37 ℃时达最大值（6.76%），酶解温度从37 ℃升至47 ℃时，多糖提取率逐渐降低。随着酶解温度的逐渐升高，酶活力增强，但超过蛋白酶的最适温度后，酶蛋白变性效应会抵消其反应速率，从而使酶活力减弱，提取率降低。因此，胰蛋白酶酶解的最适温度为37 ℃。

2. 2. 5 加酶量对鲍鱼内脏多糖提取率的影响 在酶解时间3 h、料液比1∶40、pH 8.0、酶解温度37 ℃的条件下，考察加酶量（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%）对酶法提取鲍鱼内脏多糖效果的影响。由图6可看出，加酶量在1.0%～2.0%范围内，多糖提取率逐渐增加，2.0%时达最大值（6.73%），加酶量在2.0%～3.0%范围内，多糖提取率逐渐降低。加酶量从1.5%增加至3.0%的多糖提取率间无显著差异，但2.0%加酶量与1.0%加酶量存在显著差异。在酶与底物饱和之前，加酶量越大，反应越充分，多糖提取率越高；当加酶量饱和后，蛋白与酶完全结合，若继续添加酶制剂，不仅无法提高酶解效果，还会增加蛋白杂质含量，同时一些小分子多糖会随着醇沉被除去，导致多糖提取率下降。综合考虑，胰蛋白酶提取鲍鱼多糖的最适加酶量为2.0%。

2. 3 响应面结果分析

2. 3. 1 响应面试验结果 利用SPSS 20.0对胰蛋白酶的单因素试验进行显著性分析，从图2～图6可发现，酶解时间和酶解温度对鲍鱼内脏多糖提取率无显著影响，而料液比、pH和加酶量对多糖提取率有显著影响。因此，选取料液比（A）、pH（B）和加酶量（C）3个因素为自变量，以多糖提取率（Y）为考察指标进行响应面试验，结果见表3。

2. 3. 2 回归方程及参数分析 通过Design Expert 8.0.6对表3的试验结果进行拟合分析，得到二次回归方程Y=6.980-0.066A+0.056B+0.038C+0.110AB-（2.500E-0.030）AC+0.052BC-0.230A2-0.180B2-0.230

C2。

对回归方程进行方差分析，结果（表4）表明，该回归模型P=0.0011<0.01，表明二次方程拟合极显著，失拟项P=0.6159>0.05不显著，表明该模型准确。R2=0.9468，表明方程能很好地代表各因素与多糖提取率之间的关系（王姣等，2015），可通过方程确定胰蛋白酶酶解鲍鱼内脏多糖的最佳工艺。根据F大小，各因素对鲍鱼内脏多糖提取率的影响顺序为A>B>C。根据P变化可知，A2、B2和C2对多糖提取率影响极显著（P<0.01），AB对多糖提取率影响显著，A、B和C不显著，与单因素试验结果相一致。

2. 3. 3 响应面交互作用分析 采用Design Expert 8.0.6对表3数据进行拟合分析，绘制等高线和响应面（图7）。从拟合的响应面图可直观看出各因素间的交互作用，曲面图的陡峭程度代表各因素对多糖提取率的影响程度。响应面坡度越陡，说明该因素影响较大。从图7可看出，AB响应面坡度较陡，而BC、AC响应面坡度较平缓，说明料液比与pH的交互作用对鲍鱼内脏多糖提取率影响显著，而料液比与加酶量、pH与加酶量的交互作用对多糖提取率影响不显著；料液比响应面的陡峭程度大于pH和加酶量，pH响应面的陡峭程度大于加酶量，说明料液比对多糖提取率的影响大于pH和加酶量，pH对多糖提取率的影响大于加酶量，与表4的方差分析结果相符合。

2. 3. 4 工艺优化及模型验证 采用Design Expert 8.0.6进行分析处理，得到胰蛋白酶酶解鲍鱼内脏多糖的最优条件为：料液比1∶48.9、pH 8.57、加酶量2.05%，在此条件下鲍鱼内脏多糖提取率为6.99%。为检验模型预测的准确性，并考虑实际操作，将工艺参数优化为料液比1∶49、pH 8.6、加酶量2.1%，以此条件进行重复试验，得到多糖提取率为6.97%，与预测值接近，表明建立的模型可用于预测实际值。

3 讨论

多糖的提取方法通常有热水浸提法、酸碱提取法、酶法提取和仪器辅助提取法等。由于热水浸提法提取率低，酸碱提取法具有局限性，会破坏多糖活性，因此现阶段主要采用酶法提取和仪器辅助提取法。程婷婷等（2008）通过单因素和正交试验得到碱性蛋白酶提取鲍鱼内脏多糖的最佳提取工艺：酶解温度45 ℃、料液比1∶45、pH 10、加酶量2%、酶解时间3 h，在此条件下多糖提取率为6.5%；罗晓航等（2012）利用仪器辅助提取法，将样品用高压脉冲电場进行前处理，通过正交试验优化鲍鱼内脏多糖提取工艺条件，多糖含量可达21.73%。本研究以杂交鲍内脏为原料，通过碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和Alcalase蛋白酶6种酶提取鲍鱼内脏多糖，以多糖提取率为考察指标，最终得出胰蛋白酶的鲍鱼内脏多糖提取率最高。这是由于不同种类蛋白酶的酶切位点不同，可能鲍鱼内脏糖蛋白的胰蛋白酶酶切位点较多，使其内脏多糖可更多的被切除出来，从而提高多糖提取率。因此确定胰蛋白酶作为提取鲍鱼内脏多糖的适宜酶制剂。通过响应面法优化多糖提取条件，在料液比1∶49、pH 8.6、加酶量2.1%的条件下得到鲍鱼内脏多糖提取率为6.97%，较酶筛选时的3.56%高，是由于筛选试验只是针对酶的最适环境，而提取过程是酶与底物的共同作用，因此其最适条件有所不同；响应面优化的工艺条件即为酶与底物的最佳工艺条件，因此其提取率会增加。本研究获得的鲍鱼内脏多糖提取率与程婷婷等（2008）获得的多糖提取率6.5%相近，可能由于均采用酶法提取；相比于罗晓航等（2012）的仪器辅助提取法，单一酶提取法的多糖提取率较低，下一步可将仪器辅助与复合酶法相结合进行多糖提取工艺研究，如微波辅助复合酶法等。

殷红玲等（2006）通过正交试验得到木瓜蛋白酶提取鲍鱼肉中多糖的最佳提取工艺条件，但由于正交的局限性并不能得到理论的最优值。响应面可反映出因素间的交互作用并找出最优点（何念武等，2016），本研究通过响应面分析，得到单因素及两两因素间交互作用对鲍鱼内脏多糖提取率的影响，其中料液比与pH的交互作用影响显著，而料液比与加酶量、pH与加酶量的交互作用影响不显著；料液比对多糖提取率的影响大于pH和加酶量，pH对多糖提取率的影响大于加酶量。

4 结论

通过响应面试验优化的胰蛋白酶酶解工艺可有效提取鲍鱼内脏多糖，建立的回归模型可用于实际生产预测。

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（責任编辑 罗 丽）