密度胁迫对黑鲷运输存活率及免疫酶活性的影响

李丹丹 陈丕茂 朱爱意 袁华荣 冯雪 王文杰

摘要：【目的】研究密度胁迫对黑鲷鱼苗运输存活率及免疫酶活性的影响，筛选出适宜的运输密度，为黑鲷科学运输提供参考依据。【方法】选取体长9.0～11.7 cm的健康黑鲷鱼苗490尾，共设5个密度组（D1、D2、D3、D4和D5），每袋对应装入黑鲷鱼苗10、15、20、25和30尾，采用塑料袋充氧密封运输方式，运输时间2 h 45 min，分别于运输后0、6、12、24和48 h共5个时间点取样检测，对比不同密度运输后黑鲷幼鱼鳃丝Na+/K+-ATPase酶（NKA）和肝脏超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、乳酸脱氢酶（LDH）活性及总蛋白（TP）、丙二醛（MDA）含量的变化。【结果】采用塑料袋充氧密封运输方式，各密度组的黑鲷鱼苗存活率均为100%，运输后恢复48 h的存活率仍为100%。经塑料袋充氧密封运输2 h 45 min后，各密度组黑鲷鱼苗鳃丝组织中的NKA活性显著低于运输前水平（P<0.05，下同），肝脏组织中的SOD和CAT活性显著高于运输前水平，但三者均在恢复12 h后达到峰值；肝脏组织中的MDA含量整体上呈先增后降的变化趋势，除D1组外其他密度组的MDA含量均在恢复6 h后达到峰值，随后缓慢下降，恢复48 h后D1、D2、D3和D4组的MDA含量基本恢复到运输前水平；肝脏组织中的TP含量显著低于运输前水平，恢复48 h后其含量明显升高，但仍低于运输前水平；肝脏组织中的LDH活性随时间推移的变化趋势各不相同，D1、D2和D3组的LDH活性整体上呈逐渐降低趋势，D4和D5组的LDH活性则呈先增后降的变化趋势。【结论】密度胁迫对黑鲷鱼苗运输存活率无影响，但其免疫酶活性及代谢能力均受影响，需在运输后暂养48 h才开始或基本恢复到运输前水平。在实际生产中，采用塑料袋充氧密封运输且运输时间不超过3 h时，以每袋装20～25尾9.0～11.7 cm規格的黑鲷鱼苗为宜。

关键词： 黑鲷；运输密度胁迫；存活率；免疫酶活性

中图分类号： S965.231 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）07-1439-08

0 引言

【研究意义】鱼类属于低等脊椎动物，极易受外界环境影响，且在不同生长发育阶段不同鱼种甚至相同鱼种不同个体对各种环境胁迫的抵抗能力存在明显差异（洪磊和张秀梅，2004）。鱼类种苗期是其生长的关键时期，此时其免疫抵抗能力较弱，更易受外界环境影响，尤其在增殖放流和养殖生产过程中，拉网、捕捉、排污和运输等操作均不可避免地增加鱼类额外能量消耗，致使其产生应激反应。虽然应激反应是一种条件反射式的保护机制，但机体持续处于应激状态，则会增加各类病原的敏感性甚至导致鱼病暴发（王文博等，2004；翁朝红等，2008；王丽娜等，2017）。运输作为鱼类生产养殖和放流工作中的必需环节，集合了密度变化、操作、振动及运输水体环境变化等众多胁迫因子，会引发机体发生一系列的快速生理变化（Koolhaas et al.，2011）。因此，研究运输胁迫因子对鱼类免疫及代谢能力的影响，对确定最适运输方式及评估鱼苗放养存活率等具有重要意义。【前人研究进展】关于水产活体运输，至今已有诸多学者开展了相关研究，尤其是运输后鱼体血清和组织中皮质醇、血糖、乳酸及游离脂肪酸等的变化情况（Urbinati et al.，2004；洪磊和张秀梅，2005；Boerrigter et al.，2015；Honryo et al.，2018）。Barton等（2003）研究了玻璃梭鲈幼鱼在捕捞、运输及放流过程中血浆皮质醇和氯化物的应激反应；Urbinati等（2004）研究了头石脂鲤幼鱼在装卸及不同密度运输后皮质醇和血糖等生理指标的变化情况；洪磊和张秀梅（2005）研究发现，停食24 h后的许氏平鮋和花鲈经运输船运输后装入双层充气塑料袋再以汽车运输，二者的血糖含量均呈上升趋势；彭士明等（2011）研究表明，银鲳幼鱼在4、8和16 g/L的运输密度下运输12 h后，其血清皮质醇、血糖和肌肉乳酸含量均显著升高，但肝脏和肌肉组织中的糖元含量显著降低；寇祥明等（2012）以克氏原螯虾苗为研究对象，开展了不同盐度条件下运输模拟试验，结果发现在运输时间相同和同等盐度条件下，NaCl组的运输效果优于Na2SO4组；孙鹏等（2014）研究表明，日本黄姑鱼经箱式货车（60 km/h）连续运输6 h，其肝脏中超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活力快速升高并显著高于运输前，之后逐渐下降恢复到正常水平，同时证实SOD和CAT可作为有效的生物指示剂用于胁迫状态检测；Tacchi等（2015）研究表明，虹鳟的皮肤及皮肤微生物在运输应激期间发生了重要的生理反应，即活体运输前必须检测鱼体皮肤的健康情况，运输过程中则需关注其体色变化情况；Honryo等（2018）研究表明，运输后前3 d是金枪鱼鱼苗运输胁迫恢复的关键时期，有必要采取适当的技术管理手段以减少死亡率。【本研究切入点】黑鲷又名黑棘鲷（Sparus inacrocephalus），俗称海鲋、青郎、乌颊、牛屎鱲、乌翅、黑加吉、海鲫、铜盆鱼等，其肉质鲜美，营养丰富，具有较高的经济价值，是我国沿海地区重要的增殖放流和养殖品种，但至今未见运输胁迫对黑鲷鱼苗影响的相关研究报道。【拟解决的关键问题】以黑鲷鱼苗为研究对象，采取塑料袋密封充氧运输方式，对比不同密度运输后黑鲷幼鱼鳃丝Na+/K+-ATPase酶（NKA）和肝脏SOD、CAT、LDH活性及总蛋白（TP）、丙二醛（MDA）含量的变化，筛选出适宜的运输密度，为黑鲷科学运输提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

黑鲷鱼苗购自广东大亚湾南澳养殖场，选取健康活泼的鱼苗共490尾，其体长9.0～11.7 cm，平均10.9±1.0 cm，体质量10.5～20.7 g/尾，平均18.2±3.8 g/尾。采用养殖生产和增殖放流中常用的塑料袋密封充氧运输方式，运输用透明塑料袋规格长50 cm、宽30 cm（未充氧时），每袋装入育苗池海水4400 mL（水温27.7 ℃，盐度27‰，pH 8.04）。

1. 2 模拟运输试验

共设5个密度组（D1、D2、D3、D4和D5），即每袋对应装入黑鲷鱼苗10、15、20、25和30尾，每组设3个平行。每袋充氧至饱和后立即用塑料圈封闭，试验过程中每30 min晃动3下以便氧气与海水混合。黑鲷鱼苗装袋后用别克商务车运输，运输过程中调节车内温度保持27.0 ℃。运输起点为大亚湾南澳养殖场，终点为中国水产科学研究院南海水产研究所深圳试验基地，运输时间2 h 45 min，全程禁食。运输结束后，将各密度组鱼苗分别暂养于可控温暂养池（水温27.0 ℃，盐度29‰，pH 8.00）的不同网箱内。

1. 3 样品采集与检测分析

分别在运输结束后的0、6、12、24和48 h共5个时间点取样，同时从广东大亚湾南澳养殖场育苗池随机采集9尾黑鲷鱼苗为对照。样品鱼置于碎冰上快速解剖取其鳃丝和肝脏组织，以电子天平称重，按1∶9（g/mL）比例加入9倍的0.86%生理盐水，液氮研磨，2500 r/min离心10 min，收集上清液，-80 ℃保存。鳃丝NKA活性及肝脏TP含量、MDA含量、SOD活性、CAT活性和LDH活性均采用南京建成生物工程研究所研发的试剂盒进行检测分析。

1. 4 统计分析

试验数据采用Excel 2010进行统计分析，并以SPSS 19.0中的Duncans进行多重比较。

2 结果与分析

2. 1 密度胁迫运输后黑鲷鱼苗的存活率

从大亚湾南澳养殖场运输至中国水产科学研究院南海水产研究所深圳试验基地，运输时间2 h 45 min，不同密度组的黑鲷鱼苗存活率均为100%，运输后恢复48 h的存活率仍为100%。

2. 2 密度胁迫运输后黑鲷鱼苗鳃丝组织中的NKA活性

经塑料袋充氧密封运输2 h 45 min后，各密度组黑鲷鱼苗鳃丝组织中的NKA活性随时间推移呈波动性变化，且低密度组的酶活性整体上高于高密度组。运输后0 h，各密度组的NKA活性均显著低于对照组（P<0.05，下同），且低密度组的NKA活性高于高密度组；恢复12 h后各密度组的NKA活性均达到峰值，恢复24 h后各密度组的酶活性降至最低水平，但在恢复48 h后各密度组的NKA活性呈缓慢回升趋势，其中，D1、D2和D3组基本恢复到运输前水平（图1）。

2. 3 密度胁迫运输后黑鲷鱼苗肝脏组织中各指标的变化规律

2. 3. 1 SOD活性 经塑料袋充氧密封运输后，各密度组黑鲷鱼苗肝脏组织中的SOD活性整体上显著高于运输前水平，且密度胁迫与SOD活性呈负相关。运输后0 h，各密度组的SOD活性显著高于对照组；恢复12 h后各密度组的SOD活性达到峰值，此后SOD活性缓慢降低，至恢复48 h后，D1～D4组的SOD活性仍显著高于对照组，而D5组的SOD活性显著低于对照组（图2）。

2. 3. 2 CAT活性 经塑料袋充氧密封运输后，各密度组黑鲷鱼苗肝脏组织中的CAT活性呈波动性变化，且低密度组的CAT活性高于高密度组。运输后0 h，各密度组的CAT活性显著高于运输前水平，其中，D1和D2组的CAT活性显著高于其他密度组，D4和D5组的CAT活性相近；恢复12 h后各密度组的CAT活性达最高值，随后缓慢下降；恢复48 h后，D1和D2组的CAT活性仍显著高于运输前水平，D3和D4组的CAT活性基本恢复到运输前水平，D5组的CAT活性则显著低于运输前水平（图3）。

2. 3. 3 MDA含量 经塑料袋充氧密封运输后，各密度组黑鲷鱼苗肝脏组织中的MDA含量整体上呈先增后降的变化趋势，且MDA含量与密度呈正相关，高密度组的MDA含量波动明显大于低密度组。运输后0 h，D1和D2组的MDA含量略高于运输前水平，但差异不显著（P>0.05），D5组MDA含量则显著高于对照组；除D1组外其他密度组的MDA含量均在恢复6 h后达到峰值，随后缓慢下降；恢复48 h后D1、D2、D3和D4组的MDA含量基本恢复到运输前水平，而D5组的MDA含量显著高于运输前水平（图4）。

2. 3. 4 TP含量 经塑料袋充氧密封运输后，各密度组黑鲷鱼苗肝脏组织中的TP含量均低于对照组，且低密度组的TP含量高于高密度组。各密度组的TP含量随时间推移呈轻微波动性变化。运输后0 h，D1和D2组的TP含量相近，但显著高于其他密度组；恢复6～24 h，各密度组的TP含量有轻微波动，但在恢复48 h后，各密度组的TP含量均显著升高，其中，D1组的TP含量基本恢复到运输前水平，其他密度组的TP含量仍显著低于对照組（图5）。

2. 3. 5 LDH活性 经塑料袋充氧密封运输后，各密度组黑鲷鱼苗肝脏组织中的LDH活性随时间推移的趋势各不相同，D1、D2和D3组的LDH活性整体上呈逐渐降低趋势，D4和D5组的LDH活性则呈先增后降的变化趋势。运输后0 h，各密度组的LDH活性均显著高于对照组，且低密度组的LDH活性高于高密度组；恢复12 h后，D4和D5组的LDH活性达最高值；恢复48 h后，D1和D2组的LDH活性基本恢复到运输前水平，D3、D4和D5组的LDH活性仍显著高于对照组（图6）。

3 讨论

3. 1 密度胁迫运输对黑鲷鱼苗鳃丝组织中NKA活性的影响

NKA镶嵌在细胞膜类脂双分子层中，是一种具有腺苷酸三磷酸酶活性的特异蛋白质，其在离子平衡、能量代谢、物质运送、氧化磷酸化和维持细胞膜完整性等方面发挥重要作用，被认为是评价机体对外界胁迫敏感性的重要生物酶之一（王维娜等，2004；谭树华等，2007；苏慧等，2012）。由于NKA在鱼类鳃组织中保持较高活力，便于启动膜蛋白运输及离子通道以维持细胞内环境（渗透压调节和离子平衡），因此鳃组织是鱼类最主要的NKA活力器官（Evans et al.，2005；Yang et al.，2009）。已有研究表明，环境突变引起的渗透压改变，能促使机体新陈代谢变化，NKA被激活，直至渗透压趋于平衡（He et al.，2009）。例如，史氏鲟和条石鲷为适应外界环境的变化，其鳃组织NKA活性调节分为3个阶段，即应激反应阶段、主动调节阶段和适应阶段（赵峰等，2006；孙鹏等，2014）。本研究结果表明，经塑料袋充氧密封运输后，各密度组黑鲷鱼苗鳃组织中的NKA活性显著降低，但恢复12 h后各密度组的NKA活性均达峰值，恢复24 h后各密度组的酶活性又降至最低水平，与赵峰等（2006）的研究结论相同。恢复前期鳃组织中NKA活性降低，可能是处于应激反应阶段，密度胁迫运输后的黑鲷鱼苗呼吸频率变慢致使细胞膜的通透性受抑制而阻止过多离子渗透，呈被动式渗透压调整（Rodríguez et al.，2002）；而后随着机体的恢复，NKA活性不断提高，离子外排机制激活，黑鲷开始主动调节渗透压；恢复48 h后，D1、D2和D3组NKA活性基本恢复到运输前水平，说明机体调节基本维持了鱼体内外的渗透平衡。

3. 2 密度胁迫运输对黑鲷鱼苗肝脏组织中SOD和CAT活性的影响

研究SOD和CAT的动态变化可推测出机体体内自由基的代谢及组织的氧化损伤程度，对判断机体免疫防御能力具有重要意义（洪美玲等，2007）。SOD和CAT作为生物体内的主要抗氧化酶，SOD将机体内产生的活性氧自由基（ROS）分解成H2O2，CAT则将H2O2还原成氧分子和水，从而维持细胞或机体的正常生理活动（Parihar et al.，1997）。本研究结果表明，经塑料袋充氧密封运输后，各密度组黑鲷鱼苗肝脏组织中的SOD和CAT活性均高于运输前水平，是由于运输密度胁迫造成黑鲷鱼苗体内ROS过量产生，进而诱发抗氧化酶活性增强（李效宇等，2003）；恢复12 h后SOD和CAT活性达到峰值，与谢明媚等（2015）对银鲳幼鱼胁迫处理后的研究结果相似；而后逐渐降低，恢复48 h后，D1和D2组的SOD和CAT活性仍显著高于运输前水平，D5组的SOD和CAT活性则显著低于运输前水平。说明低密度组黑鲷鱼苗能通过机体产生的SOD和CAT及时清除胁迫产生的自由基，从而维持正常的生理代谢；但高密度组由于受密度胁迫运输的影响较大，其机体内积累大量自由基而造成机体损伤，致使其抗氧化能力下降（陈成勋等，2011）。

3. 3 密度胁迫运输对黑鲷鱼苗肝脏组织中MDA含量的影响

MDA不仅是反映机体脂质过氧化程度的指标，还能表征细胞膜的受损程度（陈海刚等，2009）。本研究发现，经塑料袋充氧密封运输后，D1和D2组黑鲷鱼苗肝脏组织中的MDA含量与对照组接近，随着恢复时间的推移，其变化程度较缓且在恢复48 h后基本恢复到运输前水平，与谢明媚等（2015）研究报道的急性温度胁迫处理后银鲳幼鱼的变化规律相似。说明D1和D2组黑鲷鱼苗受密度胁迫运输产生的自由基能够被体内的SOD和CAT及时清除，有效维持抗氧化系统的平衡。除D1组外其他密度组的MDA含量均在恢复6 h后达峰值，随后逐步下降；恢复48 h后，D3组的MDA含量基本与运输前水平一致，而D5组的MDA含量显著高于运输前水平。说明黑鲷鱼苗受密度胁迫影响较大时，机体内产生的过量自由基打破了原有的氧化平衡，进而引发脂质过氧化反应（冯连华，2012）。

3. 4 密度胁迫运输对黑鲷鱼苗肝脏组织中TP含量的影响

鱼类的主要能量来源有糖类、脂肪和蛋白质，当鱼类面临环境胁迫时，体内能量代谢发生的主要变化包括：血糖和血液乳酸含量增高，肝糖原加速消耗，游离脂肪酸含量发生变化，蛋白质分解加快（周玉等，2001；冯广朋等，2010）。由于应激状态下鱼类需要更多地动用自身储存的能量，当机体体内的糖类和脂肪含量较低时，蛋白质通过一系列生化分解后进入血液为各组织器官供能（钱云霞等，2002）。本研究结果发现，密度胁迫运输后黑鲷鱼苗肝脏组织中的TP含量显著低于运输前水平，且低密度组的TP含量高于高密度组。钱云霞等（2002）研究表明，饥饿胁迫下的鲈鱼体内TP含量随饥饿时间延长而下降；赛娜和宋凯（2011）研究表明，温度偏高或偏低均会使中华鲟鱼体内TP含量下降，运输胁迫后牙鲆TP含量也呈降低趋势。说明密度胁迫运输会促使黑鲷鱼苗处于应激状态，且对其免疫机能造成一定影响。恢复48 h后，除D1组的TP含量基本恢复到运輸前水平外，其他密度组的TP含量仍显著低于运输前水平，尤其是D5组的黑鲷鱼苗可能因密度胁迫影响较大，致使其能量分解代谢加快，而导致TP含量一直保持在较低水平。

3. 5 密度胁迫运输对黑鲷鱼苗肝脏组织中LDH活性的影响

LDH是糖酵解途径与TCA循环的关键酶，不仅与细胞代谢关系密切，还可通过催化丙酮酸和乳酸直接转化产生能量（Valarmathi and Azariah，2003；Abdelmohsen，2012）。LDH活性从根本上取决于细胞内氧分压的高低，氧分压降低时，LDH合成加快且活力增强，因此可作为一种衡量无氧代谢水平的指标（赵伟民等，2011）。当机体组织器官发生病变时，其自身的LDH也会发生变化，即LDH在评价鱼类健康方面具有重要意义（毛瑞鑫等，2009）。经铅暴露胁迫处理后中华鲟幼鱼体内的LDH活性升高且随胁迫的增加而增强（章龙珍等，2010）。本研究结果表明，经密度胁迫运输后，D1、D2和D3组黑鲷鱼苗肝脏组织中的LDH活性在恢复期整体上呈逐渐降低趋势，恢复48 h后，D1和D2组的LDH活性基本恢复到运输前水平。运输后各密度组的LDH活性升高表明密度胁迫运输增加了鱼体的游动，以此调节适应环境变化和维持生命代谢比例的增加，胁迫处理期间无氧呼吸增加（李佳凯等，2015）。LDH从肝胰脏携带胆固醇输送到周围血管，其活性增强时可造成过多的胆固醇存积在血管壁上，引起动脉粥样硬化，即过高的LDH不利于健康（李彦明等，2008）。由此推测，D4和D5组黑鲷鱼苗肝脏组织受损较严重。

4 结论

密度胁迫对黑鲷鱼苗运输存活率无明显影响，但其免疫酶活性及代谢能力均受影响，需在运输后暂养48 h才开始或基本恢复到运输前水平。在实际生产中，采用塑料袋充氧密封运输且运输时间不超过3 h时，以每袋装20～25尾9.0～11.7 cm的黑鲷鱼苗为宜。

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（責任编辑 兰宗宝）