液相色谱-串联质谱测定饲料中溴吡斯的明

王威利，李亚菲，张 展，何绮霞，黄晓梅，苏秋权，丁晨红，林雪贤，殷秋妙，吴维煇*

(1.广东省农业科学院 农产品公共监测中心，广东 广州 510640；2.农业部农产品质量安全风险评估实验室(广州)，广东 广州 510640；3.农业部农产品质量安全检测与评价重点实验室，广东 广州 510640)

溴吡斯的明(Pyridostigmine bromide，PB)是新斯的明的衍生物，为拟胆碱药中的抗胆碱酯酶药。进入机体后，通过可逆性抑制胆碱酯酶活性[1-2]，使乙酰胆碱不能水解，从而提高体内受体部位的乙酰胆碱浓度，呈现出全部胆碱能神经兴奋的效应，如引起胃肠、子宫和膀胱平滑肌收缩等[3]。在养殖业，PB常用于治疗牛羊前胃疾病、动物便秘以及分娩期和产后疾病等[2]，对长期血流不畅造成的神经肌肉衰弱也有良好疗效。PB的长期大剂量使用，可能会引起畜禽动物体内乙酰胆碱蓄积而发生集体中毒，表现腹泻、呕吐、胃痉挛等症状[4]，造成严重损失。PB仅被允许直接给药用作治疗，根据《饲料药物添加剂使用规范》[5]，禁止在饲料中使用。但随着养殖业集约化、规模化发展，PB作为治疗药物，有违法在饲料中滥用和添加用作治疗和预防的安全风险。由于目前缺少相应的检测方法及标准，无法对市场上PB的使用情况进行排查及监测。因此，建立饲料中PB含量的测定方法，可规范饲料中添加剂药物使用，为监控饲料中PB的使用情况以及饲料质量安全风险评估的深入研究提供技术支持。

目前，国内外关于PB药物残留的检测方法研究较少，且大多为动物血浆中PB的测定和药代动力学研究，主要采用放射免疫法、气相色谱法、离子对色谱法、高效液相色谱法等[6-25]。但由于饲料成分复杂、基质干扰较大，针对饲料中PB的检测方法国内外尚未见报道。本文基于液相色谱-串联质谱法的高选择性、高灵敏度和定性准确等特点，建立了饲料中PB的快速定性定量方法，能满足饲料质量安全检测和国家药物监控的要求。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

LC-MS/MS8040三重四极杆串联质谱仪(岛津公司)，配电喷雾离子源(ESI)；Milli-Q超纯水器(Merk Millipore公司)；电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；H2050高速冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；氮吹仪(美国Organomation Associates Inc.)；旋涡仪(Labnet公司)。甲醇、乙腈、甲酸、甲酸铵(色谱纯，Merck公司)；正己烷(分析纯，广州试剂厂)；PB标准品(含量：99.4%，中国食品药品检定研究院)；内标PB-D6(含量：98.0%，TLC PharmaChem Inc.)；混合性弱阳离子交换柱(WCX，150 mg/6 mL，日本岛津公司)；实验用水为超纯水。

1.2 标准溶液的配制

标准储备液：准确称量PB和内标PB-D6标准品适量，分别置于10 mL容量瓶中，用乙腈定容，配成1 g/L标准储备溶液，避光-18 ℃贮存。标准储备液用乙腈稀释定容，制成10 mg/L的标准中间液，-18 ℃贮存。

标准工作溶液：精密吸取一定量的PB标准储备液和PB-D6标准中间液至10 mL容量瓶中，用10%乙腈水溶液逐步稀释成1、2、5、10、20、50、100 μg/L的溶剂标准工作液(内标PB-D6均为5 μg/L)，分别用不同类型饲料空白阴性样品的提取液配制相应的基质标准溶液，供测定。

内标PB-D6工作液：准确量取一定量内标PB-D6标准中间液置于10 mL容量瓶中，用乙腈定容，配成100 μg/L 的内标工作溶液，4 ℃贮存。

1.3 样品前处理方法

1.3.1配合饲料、浓缩饲料、精料补充料称取(2±0.05) g饲料于50 mL具塞离心管中，准确加入100 μL内标PB-D6工作溶液，加入20 mL甲醇，涡旋混匀30 s，超声提取10 min，以10 000 r/min离心5 min，取10 mL上清液置于50 mL离心管中，于50 ℃水浴中氮吹至近干后，加10 mL超纯水溶解，待净化。

1.3.2添加剂预混合饲料称取(2±0.05) g饲料于50 mL具塞离心管中，准确加入100 μL内标PB-D6工作溶液，加入20 mL乙腈，涡旋混匀30 s，超声提取10 min，以10 000 r/min离心5 min，取10 mL上清液置于50 mL离心管中，于50 ℃水浴中氮气吹至近干后，加10 mL超纯水溶解，待净化。

1.3.3净化在上述溶液中加入10 mL正己烷净化脱脂，涡旋30 s，10 000 r/min离心 5 min，弃去上层正己烷。取混合型弱阳离子交换柱WCX，依次用6 mL甲醇和6 mL水活化，取5 mL样品提取液过柱，弃去流出液，再依次用水、甲醇各6 mL淋洗，减压抽干，弃去淋洗液，用10 mL 1%甲酸甲醇溶液洗脱，洗脱液于水浴中50 ℃氮气吹干，用10%乙腈水溶液0.5 mL超声溶解，涡旋30 s，过0.22 μm滤膜，供测定。

1.4 色谱-质谱条件

色谱条件：HR-ODS-C18色谱柱(150 mm×3.0 mm×3 μm，岛津公司)；柱温：40 ℃；流动相：A为5 mmol/L甲酸铵-0.1%甲酸水溶液，B为乙腈；流速0.3 mL/min；进样量：5 μL；线性梯度洗脱程序：0～1.2 min，3%～15% B；1.2～5.8 min，15% B；5.8～6.5 min，15%～ 50% B；6.5～8.0 min，50%B；8.0～8.5 min，50%～ 3% B；8.5～12 min，3%B。

质谱条件：采用电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描，电离电压4.5 kV，加热模块400 ℃，多反应监测(MRM)方式检测，其他质谱条件见表1。

表1 溴吡斯的明的质谱参数Table 1 Mass spectrometric parameters of pyridostigmine bromide

*quantitative ion,dwell time：0.1 s

2 结果与讨论

2.1 流动相的选择

乙腈和甲醇为液相色谱常用的有机相，二者对药物溶解性有差异，实验对比了二者作为有机相时对PB色谱峰形的影响。结果表明，乙腈作为有机相时PB的峰形和保留时间均优于甲醇，因此选择乙腈为有机相。

实验尝试在0.1%甲酸水流动相中加入甲酸铵，发现加入甲酸铵后PB的峰形显著改善，且响应值提高。随后比较了在0.1%甲酸水中加入终浓度为5、10 mmol/L甲酸铵的效果，结果显示，甲酸铵浓度对PB响应值及峰形影响不明显，因此选择5 mmol/L甲酸铵-0.1%甲酸水为水相。

2.2 样品提取溶剂的确定

由于PB为强极性物质，且饲料种类多、组分差别较大，实验分别选用乙腈、1%甲酸乙腈溶液、甲醇、氯仿、乙醇、水为提取溶剂，考察了其对配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料和精料补充料代表性饲料的提取效果。结果发现，以水为提取剂时，配合饲料及浓缩饲料的回收率较高，但由于饲料中其他组分和较高含量的无机盐易溶于水，不利于后续净化处理，且不挥发性无机盐对仪器分析有损害。因此，选择配合饲料、浓缩饲料、精料补充料的提取剂为甲醇，添加剂预混合饲料的提取剂为乙腈。

2.3 样品的净化

采用甲醇和乙腈提取时无机盐溶解虽然较少，但提取出的非极性脂类较多，影响实验结果的稳定性，因此需对样品提取液进一步净化。

图1 配合饲料中PB的特征离子质量色谱图Fig.1 MRM chromatograms of pyridostigmine bromide in compound feed sampleA：standard solution；B：blank sample；C：PB in compound feed sample

实验在样品提取溶液中加入正己烷进行除脂，结果表明正己烷的脱脂效果良好，PB的回收率达96%以上，基质干扰也有所降低。但正己烷不能除去提取液中的无机盐，因此实验考察了PSA、HLB小柱、MCX小柱、WCX(150 mg/6 mL)和WCX(60 mg/3 mL)净化柱作为固相分散净化吸附剂的效果。结果表明，PSA对PB有少量吸附，PB的回收率为80%左右。HLB对PB的保留效果较差，一部分目标物随提取液流失，回收率为60%左右。由于PB是一种盐，其在水溶液(pH值近中性)中离解出正离子基团和溴负离子，而MCX小柱为混合性强阳离子交换柱，带有很强的磺酸基团，对PB具有很强的保留效果，很难将其洗脱。而混合性弱阳离子交换柱WCX(150 mg/6 mL)，带有羧酸基，对PB正离子基团的保留效果很好，并且易于洗脱。通过对比WCX(150 mg/6 mL)和WCX(60 mg/3 mL)两种规格小柱发现，PB在WCX(150 mg/6 mL)上的回收率接近100%，在WCX(60 mg/3 mL)上的回收率仅90%左右，且在水溶液上样WCX(150 mg/6 mL)固相柱的流出液中未检出PB。因此，最终选用WCX(150 mg/6 mL)小柱作为净化用固相萃取小柱。

2.4 洗脱体积的选择

考察了1%甲酸甲醇作为洗脱剂时不同洗脱体积(1、2、5、10、15、20 mL)对WCX上PB的洗脱情况。当洗脱体积为10 mL时，能完全将净化柱上的PB洗脱下来，最终选择洗脱体积为10 mL。

2.5 标准溶液的稳定性试验

分别量取适量的PB和PB-D6标准物质，用乙腈溶解稀释配成1 g/L标准贮备液，于-20 ℃下储存。分别用乙腈稀释成0.1 mg/L标准工作液，于4 ℃下储存。分别于储存时及储存后1、2、3、4周用流动相将标准工作液稀释成10 g/L PB标准溶液(内标5 g/L)供仪器分析，与重新配制的标准溶液进行对比，观察其峰面积的重复性。结果表明，标样在该条件下稳定，相对标准偏差(RSD)均小于2%，因此标准溶液贮备液于4 ℃冰箱中保存有效期为1个月。同时对标准贮备液进行6个月的反复冻融稳定性试验，结果表明，在-20 ℃保存的标准贮备液稳定，无明显降解和变化。

2.6 线性范围、检出限与定量下限

采用配合饲料、浓缩饲料、预混合饲料、精料补充料对应的空白阴性样品溶液，将PB和PB-D6标准工作液，逐步稀释成PB质量浓度分别为1、2、5、10、20、50、100 μg/L的溶剂标准工作液(内标PB-D6均为5 μg/L)。在优化实验条件下，以PB的质量浓度为横坐标(x,μg/L)，PB与内标的峰面积之比为纵坐标(y)，绘制标准曲线，结果如表2所示。各种饲料基质中,PB在1～100 μg/L范围内具有良好的线性关系，线性系数(r2)均大于0.999。在空白饲料中添加PB标准品，按照本方法进行样品前处理后，供液相色谱-串联质谱测定，以信噪比S/N≥3计算方法的检出限(LOD)；以S/N≥10计算方法的定量下限(LOQ)。结果显示，在不同饲料基质中PB的检出限均为1.0 μg/kg，定量下限均为2.0 μg/kg(见表2)。PB标准溶液、配合饲料空白及空白添加PB 2 μg/kg(内标PB-D6为10 μg/kg)的MRM色谱图见图1。

表2 PB在不同饲料基质中的回归方程、相关系数(r2)、检出限及定量下限Table 2 Linear equations，correlation coefficients(r2)，limits of detection(LODs)and limits of quantitation(LOQs)of pyridostigmine bromide in different feeds

2.7 回收率与精密度

选取配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料和精料补充料空白饲料样品，添加PB标准品和内标，其中配合饲料加标水平为2.0、5.0、10.0 μg/kg，浓缩饲料为2.0、5.0、50.0 μg/kg，添加剂预混合饲料为2.0、10.0、100 μg/kg，PB-D6为5.0 μg/kg，每个加标水平做5次平行。结果显示，PB在上述饲料中的平均加标回收率为96.1%～108%，RSD为2.8%～8.3%，符合方法学要求。

3 结 论

本文建立了配合饲料、浓缩饲料、预混合饲料以及精料补充料中PB的液相色谱-串联质谱分析方法，采用串联质谱和同位素内标消除了饲料复杂基质的影响，提高了定量准确性。该方法简便，灵敏度高，且方法的回收率、精密度和定量下限均符合兽药残留分析要求，可以满足实际检测工作的需要。