张 聪,周常义,江 锋,曾 磊,杨名平,苏国成*
(1.集美大学 食品与生物工程学院,福建 厦门 361021;2.厦门中集信检测技术有限公司,福建 厦门 361100)
拟除虫菊酯类农药(Pyrethroid pesticides)是仿效天然除虫菊化学结构合成的广谱性杀虫剂,因具有高效、低毒、生物降解和触杀作用强等特点,而得到了广泛应用[1]。近年来,我国拟除虫菊酯类农药中毒事件时有发生,在农产品、食品中的残留超标现象也比较突出[2-4]。该类农药有蓄积性,对哺乳动物具有神经毒性、免疫毒性、生殖毒性和遗传毒性,对一些非靶生物如昆虫和水生生物也有毒害作用[5],加之不合理的使用,其残留会对人体健康造成影响,因此,加强动物源性食品中拟除虫菊酯的检测方法研究具有重要的现实意义。
目前,国内外对拟除虫菊酯类农药的检测研究多集中于果蔬[6]、茶叶[7-8]和水体[9]等样品,且主要采用气相色谱法(GC)、气相色谱-质谱法(GC-MS)和高效液相色谱法(HPLC),可能产生假阳性,而且对食品中拟除虫菊酯的分析很少采用液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)。Z-Sep+是十八烷基硅烷基团和二氧化锆结合在同一个二氧化硅颗粒上[10]。作为两性氧化物,二氧化锆能强烈吸附含羧基、巯基的脂肪和蛋白质,将其制备成新型吸附剂用于鱼肉[11]、植物油[12]、玉米和毛豆[13]样品的前处理净化,效果比较理想。本研究采用改进的QuEChERS方法对样品前处理条件进行优化,应用高灵敏度和高分离能力的超高效液相色谱-串联质谱技术(UPLC-MS/MS)对拟除虫菊酯类农药进行检测,实现了对动物性食品中10种拟除虫菊酯类农药残留的简单、快速测定。
UItiMate3000 超高效液相色谱仪、TSQ Quantum Access Max 三重四极杆串联质谱仪(美国Thermo公司);Milli-Q 去离子超纯水系统(美国Millipore公司);3-30K 高速冷冻离心机(德国Sigma公司);XW-80A 涡旋混合器(Kylin-Bell Lab Instruments);OA-Sys 氮吹仪(美国Organomation 公司);KQ-500型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
氟氰戊菊酯、高效氯氟氰菊酯、甲氰菊酯、高效氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氟胺氰菊酯、氯菊酯、联苯菊酯和醚菊酯标准品(纯度>95.9%,农业部环境保护科研监测所);甲醇、乙腈(色谱纯,德国Merck公司);冰乙酸(优级纯,上海安谱科技公司);乙酸铵(优级纯,天津市光复科技发展有限公司);氯化钠、无水乙酸钠(分析纯,西陇科学股份有限公司);无水硫酸镁(分析纯,阿拉丁试剂有限公司);PSA、C18吸附剂(博纳艾杰尔科技有限公司);Z-Sep+吸附剂(美国Supelco公司)。
1.2.1拟除虫菊酯单标储备液的配制将10种标准品(100 mg/L)用甲醇配成10 mg/L的单标储备液,置于棕色小瓶中,于-18 ℃冰箱中保存,有效期为6个月。
1.2.2拟除虫菊酯混合标准工作液的配制分别移取上述10种拟除虫菊酯单标储备液0.1 mL,置于同一10 mL容量瓶中,用甲醇定容后制得100 μg/L的混合标准工作液,置于棕色小瓶中,于-18 ℃冰箱中保存,有效期为1个月。临用时,配成不同浓度的标准工作溶液。
1.3.1色谱条件色谱柱:ACQUITY HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm);柱温:30 ℃;流速:0.25 mL/min;进样量:5.0 μL;流动相:A为0.1%甲酸水溶液(含5 mmol/L乙酸铵),B为甲醇;梯度洗脱程序:0~2.0 min,70% B;2.0~6.3 min,70%~95% B;6.3~6.5 min,95%~70% B;6.5~10.0 min,70% B。
1.3.2质谱条件离子源:电喷雾离子源(ESI);扫描方式:正离子扫描;检测方式:多反应监测(MRM);喷雾电压:3.8 kV;雾化温度:210 ℃;离子传输温度:250 ℃;鞘气压力:7.0×103Pa;辅助气压力:1.75×103Pa;碰撞气压力:0.2 Pa;10种拟除虫菊酯的定性离子对、定量离子对、碰撞能量及锥孔电压等参数见表1。
1.4.1样品制备参照GB/T5009.162-2008[14]和文献[15]的方法,对采集的样品用粉碎装置进行处理,将处理好的样品置于密闭干净容器内并做好标记。试样于-18 ℃以下冷冻保存,备用。
1.4.2样品提取将所制得的样品解冻后,准确称取2.0 g(精确至0.01 g)置于50 mL具塞离心管中,加入1.0 g无水硫酸镁、0.3 g无水乙酸钠和0.6 g氯化钠,再加入5.0 mL冰乙酸-乙腈(1∶ 99,体积比)提取液,涡旋均匀后,超声提取10 min,8 800 r/min下离心3.5 min。将上清液全部移至另一15 mL具塞离心管中,重复提取1次,合并上清液,待净化。
1.4.3样品净化将待净化液置于-18 ℃下冷冻1 h。取3.0 mL冷冻后的上清液于含有500 mg无水硫酸镁、150 mg Z-Sep+和150 mg C18的15 mL离心管中,涡旋,8 800 r/min下离心3.5 min,取2.0 mL上清液于另一15 mL离心管中,40 ℃下氮吹至近干,用甲醇-水(3∶ 1,体积比)定容至1.0 mL,涡旋溶解残渣,过0.22 μm有机相尼龙滤膜,供UPLC-MS/MS分析。
采用蠕动泵进样的方式,将1 mg/L各拟除虫菊酯单标溶液以20 μL/min的流速连续注入ESI源中,根据目标物的分子结构特征,在正离子检测模式下进行一级质谱全扫描(Full scan),得到待测物的准分子离子峰[M+NH4]+。优化离子源气流、电压、温度等参数使离子峰的响应强度最优且响应达到稳定状态,对准分子离子峰进行二级质谱扫描,确定子离子和优化的碰撞能量。优化的质谱参数见表1。
表1 10种拟除虫菊酯农药的UPLC-MS/MS分析参数Table 1 Optimal parameters of ten pyrethroids analyzed by UPLC-MS/MS
2.2.1色谱柱的选择根据拟除虫菊酯类农药的物理化学性质,本研究选用农残分析常用的超高压反相色谱柱ACQUITY HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)[16]和Hypersil GOLD C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,3.0 μm)[17]。通过比较两种色谱柱对10种拟除虫菊酯类农药的分离效果、峰形和保留时间,发现在相同的程序洗脱条件下,前者的分离效果好,保留效果佳。因此最终选用ACQUITY HSS T3色谱柱。
图1 10种拟除虫菊酯混合标准溶液(100 μg/L)的总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram of 10 pyrethroids mixed standard solution(100 μg/L)1.flucythrinate;2.λ-cyhalothrin;3.fenpropathrin;4.β-cypermethrin;5.deltamethrin;6.fenvalerate;7.fluvalinate;8.permethrinⅠ;9.permethrinⅡ;10.bifenthrin;11.etofenprox
2.2.2流动相的选择比较了甲醇-水、乙腈-水及在水相中添加不同的调节剂甲酸(0.05%、0.1%和0.2%)、乙酸铵(2、5、10 mmol/L)的分离效果。结果发现,在水相中加入甲酸时甲氰菊酯和醚菊酯的峰形较好,这是由于流动相中加入甲酸后有利于形成[M+H]+,从而提高其离子化效率。但大部分目标物的色谱峰仍拖尾严重;而向甲酸水流动相中加入乙酸铵后,10种拟除虫菊酯均产生了[M+NH4]+母离子,且响应强度增大。将有机相甲醇换成乙腈,发现目标峰的分离程度较差且出峰时间较晚。因此,本研究采用0.1%甲酸水溶液(含5 mmol/L乙酸铵)-甲醇作为流动相。
2.2.3洗脱程序的选择由于10种拟除虫菊酯类农药的结构和性质相近,采用等度洗脱目标化合物会在色谱柱中共流出。本实验选取梯度洗脱程序,在参考文献[18-20]的基础上设置了5种梯度洗脱程序,综合对比,最终选择“1.3.1”的梯度洗脱程序。在优化色谱条件下,10 min内可完成对10种拟除虫菊酯农药的分析。其总离子流图见图1。
由于动物组织的基质相对复杂,极性较弱的目标化合物一般较难从含油脂样品中提取出来,所以本实验比较了乙腈、乙酸乙酯、丙酮及丙酮-正己烷(1∶ 1,体积比)作为提取溶剂时,对动物性食品中拟除虫菊酯类农药的提取效果。结果表明,乙腈对拟除虫菊酯的回收率明显高于其他3种溶剂。原因是乙腈对样品中油脂和色素的提取量最小,在一定程度上降低了基质干扰,有利于净化,同时其对拟除虫菊酯类农药的溶解度较高;乙酸乙酯的极性很弱,只提取了样品中部分目标化合物,回收率较低;而用丙酮和正己烷提取时,提取液中干扰物质会增加,回收率较低。由于拟除虫菊酯在碱性条件下不稳定,所以进一步研究了乙腈与冰乙酸-乙腈(体积比1∶ 999、1∶ 99、2∶ 98)对拟除虫菊酯类农药回收率的影响。结果显示,加入少量的冰乙酸时回收率增加,而冰乙酸-乙腈(2∶ 98)的回收率低于冰乙酸-乙腈(1∶ 99),可能是由于拟除虫菊酯类农药在含1%冰乙酸的乙腈溶液中比较稳定,而酸度过大时会抑制离子的传输效率。因此,选择冰乙酸-乙腈(1∶ 99)作为提取溶剂。
提取液经低温冷冻净化后,仍有部分杂质,采用分散固相萃取方法对提取液再次净化。而吸附剂种类的选取是分散固相萃取的关键,其中PSA材料的硅胶表面键合有极性官能团,具有极性吸附作用和弱阴离子交换功能,主要用于去除样品中的有机酸、色素和金属离子[21];石墨化碳黑(GCB)具有片层结构,是一种非极性吸附剂,主要用于去除样品中的色素、甾醇和维生素,但因其吸附性较强易导致部分农药的回收率偏低[22];C18的有效成分是硅胶键合的十八烷基,具有疏水性,主要用以去除脂肪和非极性物质[23];Z-Sep+是二氧化硅颗粒上同时以单键结合二氧化锆和C18的新型吸附剂,能有效吸附脂肪和色素等,被用于高含油植物中农药的净化处理[24]。
动物性食品含有较多的脂肪、蛋白质等干扰基质,在样品净化的过程中既需除去油脂等干扰物质,又需保留拟除虫菊酯农药,因此设计了4种净化方式:① 150 mg PSA和150 mg C18;② 150 mg GCB和150 mg C18;③ 150 mg Z-Sep+和150 mg C18;④ 300 mg Z-Sep+,并在每组中均加入500 mg无水硫酸镁。在25 μg/kg加标水平下,按照“1.4”方法对长毛明对虾空白样品进行前处理,以回收率为指标考察上述4种方式的净化效果。结果发现,采用PSA和C18净化时,氰戊菊酯和氟胺氰菊酯的回收率低于50%,相对标准偏差较大;采用GCB和C18净化时,回收率均较低,可能是GCB的吸附性过强所致;采用Z-Sep+净化时,回收率低于60%,可能是Z-Sep+对目标物产生了吸附;而采用Z-Sep+和C18净化时,10种拟除虫菊酯的回收率为70%~120%,符合检测方法的要求。对Z-Sep+和C18吸附剂的用量进行优化,发现用150 mg Z-Sep+和150 mg C18吸附剂能够较好地净化样品。综上所述,最终采用方法③对样品进行净化。
2.5.1基质效应在液相色谱-串联质谱定量分析的过程中,基质效应被认为是误差的重要来源,常会导致检测结果偏高或偏低[25]。基质效应(ME)可通过比较基质标准曲线和溶剂标准曲线的斜率进行评估: 通常情况下,当|ME|<20%时,为弱基质效应,可以忽略;当20%≤|ME|≤50%时,为中等程度基质效应;当|ME|>50%时,为强基质效应,须采取方法补偿基质效应[26]。
按照“1.4”方法对空白样品(长毛明对虾、锯缘青蟹、猪肉、鸭肉)进行前处理,然后配制空白基质匹配标准曲线和纯溶剂标准曲线,测定基质效应。结果表明,氰戊菊酯在锯缘青蟹中表现为较强的基质抑制效应,氯菊酯在长毛明对虾和锯缘青蟹中表现为基质增强效应,联苯菊酯在锯缘青蟹、猪肉和鸭肉中表现为弱的基质增强效应,而其他拟除虫菊酯则表现为弱到中等的基质抑制效应。所以本实验采用基质匹配标准溶液的方法,以降低基质效应的影响。
2.5.2线性范围、检出限与定量下限在优化实验条件下,用长毛明对虾、锯缘青蟹、猪肉和鸭肉4种空白样品提取液将混合标准储备液稀释,配制成2.5~100 μg/L系列基质匹配标准溶液。以目标物的质量浓度为横坐标,对应的定量离子峰面积为纵坐标绘制标准曲线。以3倍和10倍信噪比(S/N)分别计算目标物的检出限(LOD)和定量下限(LOQ)。以长毛明对虾空白基质为例,结果见表2。4种空白样品中各目标物在线性范围内呈良好的线性关系,相关系数(r2)均大于0.997,LOD为0.9~2.4 μg/kg,LOQ为3.0~8.0 μg/kg,低于最大残留限量(MRLs)[28]。
表2 长毛明对虾空白基质中拟除虫菊酯的线性方程、相关系数、线性范围、检出限及定量下限 Table 2 Linear equations,correlation coefficients(r2),linear ranges,LODs and LOQs of pyrethroids in blank Penaeus penicillatus
2.5.3回收率与精密度在优化实验条件下,选用长毛明对虾、锯缘青蟹、猪肉和鸭肉4种空白样品,对10种拟除虫菊酯进行10、50、100 μg/kg 3个水平的加标回收实验,每个加标水平重复3次,回收率和相对标准偏差(RSD)见表3。3个加标水平的平均回收率为70.3%~120%,RSD为1.2%~11.2%。结果满足欧盟SANTE/11813/2017对食品中农药残留分析的规定[27]。表明该方法的准确度和精密度达到分析要求。
表3 10种拟除虫菊酯在样品中的回收率及相对标准偏差(n=6)Table 3 Spiked recoveries and relative standard deviations(RSD)of ten pyrethroids in samples(n=6)
(续表3)
PesticideSpiked(μg/kg)Penaeus penicillatusScylla serrataPorkDuckRecovery(%)RSD(%)Recovery(%)RSD(%)Recovery(%)RSD(%)Recovery(%)RSD(%)5098.5 2.7 86.0 5.2 106 2.7 1064.6 10088.9 6.5 96.8 3.9 89.8 4.5 99.2 7.2 Bifenthrin1073.8 9.3 96.1 7.5 113 1.9 81.3 4.3 501058.6 1123.0 103 3.5 106 5.9 10082.9 11.2 108 5.6 92.6 5.3 111 9.4 Etofenprox1089.59.397.48.11098.097.96.5501008.61015.71037.388.74.710099.26.199.05.099.73.899.78.3
2.5.4实际样品的检测为验证本方法在动物性食品中的有效性,从厦门超市和农贸市场随机购买40份样品,包括长毛明对虾、锯缘青蟹、猪肉和鸭肉,采用本方法对10种拟除虫菊酯进行分析测定。其中2份长毛明对虾检出高效氯氰菊酯,含量分别为3.7、5.2 μg/kg;1份锯缘青蟹检出高效氯氰菊酯,含量为6.1 μg/kg;1份锯缘青蟹中检出溴氰菊酯,含量为7.3 μg/kg;1份长毛明对虾检出氟胺氰菊酯,含量为8.6 μg/kg;2份猪肉检出高效氯氟氰菊酯,含量分别为6.7、8.0 μg/kg;1份鸭肉检出溴氰菊酯,含量为5.5 μg/kg;1份鸭肉检出氟胺氰菊酯,含量为5.8 μg/kg。结果均未超出最大残留限量10 μg/kg的要求[28]。结果表明,该方法可用于动物性食品中10种拟除虫菊酯的检测。
本文通过优化提取溶剂和吸附剂,以及色谱和质谱条件,建立了动物性食品中10种拟除虫菊酯的改进QuEChERS/UPLC-MS/MS检测方法。研究结果表明,本方法的前处理简单、灵敏度高、准确性好,可满足动物性食品中10种拟除虫菊酯类农药残留的快速分析要求。