基于整合药理学平台探究滋补脾阴方药防治轻度认知功能障碍的物质基础与作用机制＊

周 雯，战丽彬,2＊＊

（1.南京中医药大学基础医学院 南京 210023；

2.南京中医药大学中医脾藏象现代研究实验室 南京 210023）

轻度认知功能障碍（Mild cognitive impairment,MCI）是由一个或多个认知领域（包括记忆力，注意力，执行功能，语言或视觉空间能力）受损而定义[1-2]，它作为痴呆的前驱阶段，发展为痴呆的几率明显增加，最新研究表明MCI年龄大于65岁的患者随访2年累积痴呆发生率为14.9%[3]。一旦痴呆形成，必然给患者、家庭和社会带来极大的痛苦和负担。现有药物在一定程度上能控制和缓解MCI症状，但治疗效果并不理想，因此寻找高效药物以延缓并控制MCI的发生发展具有重要的社会意义。滋补脾阴方药由人参，山药，茯苓，白芍，丹参，白扁豆，莲子，石菖蒲，远志，檀香，陈皮，甘草12味中药组成，课题组前期研究发现该方可以改善学习和记忆能力，并具有显著的神经保护作用[4-5]，但其作用的物质基础尚未清晰阐明。

作为药理学研究的新领域，整合药理学（integrative pharmacology，IP），是研究多成分药物与机体相互作用及其整合规律和作用原理的一门学科[6]。整合药理学不仅可以被广泛应用到中药方剂药效物质基础、作用机制、配伍规律等方面，以促进中药现代研究水平，而且，可以探索多成分组合药物的研究方法，为开创中西医统一的新医药学奠定基础[7]。因此，利用整合药理学平台，探究滋补脾阴方药防治轻度认知功能障碍的物质基础与作用机制，不仅有助于解决筛选物质基础时间周期长的问题，还有助于解决探寻作用机制时单靶局限性问题，便于探究滋补脾阴方药的主要活性成分群和靶标群，阐述滋补脾阴方药物质基础和作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究应用的软件为中药整合药理学计算平台（TCM-IP，www.tcmip.cn）v1.0[8]。目前有4大数据库：中药方剂数据库、中药材数据库、中药成分数据库、疾病/症状靶标数据库。该平台由中国中医科学院中药研究所联合北京大学药学院、中国科学院相关机构构建。

1.2 检索、查询

从中药材数据库获得滋补脾阴方药12味中药的名称、拉丁名、性味归经、产地、功效及其所含化合物等信息；从中药成分数据库中获得12味中药的CAS号、相对分子质量、物理化学性质以及药物代谢性质等。在疾病/症状靶标数据库中，以“Mild cognitive impairment”作为疾病或症状关键词进行检索，获得治疗“Mild cognitive impairment”的药物名称、药物疗效、药物靶标的基因和蛋白质相关信息。

1.3 靶标预测和共性靶标分析

采用二维结构相似性搜索（即MACCS分子指纹），采用开源软件OpenBabel提取化学指纹特征，使用Tanimoto系数定义的相似度计量方法，与FDA上市药物进行相似性打分（Score≥0.8），获得滋补脾阴方药作用的潜在靶标，建立药物候选靶标信息数据库。

1.4 网络构建和分析、可视化

基于滋补脾阴方药药物靶标与MCI之间的相互作用网络，建立滋补脾阴方药靶标-MCI基因互作网络；以“节点连接度（degree）”的2倍中位数为卡值，选取滋补脾阴方药靶标-轻度认知功能障碍基因互作网络的核心节点（hubs）；在构建关键节点子网的基础上，以“degree”、“节点紧密度（closeness）”和“节点介度（betweenness）”的中位数为卡值，选取同时满足3个卡值的节点为滋补脾阴方药治疗MCI失衡网络的候选靶标；然后，通过对上述滋补脾阴方药候选靶标参与的功能与通路进行富集分析，进一步挖掘滋补脾阴方药缓解MCI关键病理的分子机制，构建“滋补脾阴方药-中药材-化学成分-核心靶标-关键通路”的多层次网络关联图。

1.5 基因功能分析与通路分析

基于基因本体数据库（gene ontology，GO）和KEGG（http://www.genome.jp/kegg/）通路数据库，提取滋补脾阴方药靶标的分子功能（molecular function）、细胞内定位（subcellular localization），及其所参与的生物学反应（biological process）和通路（pathway），进行富集计算。针对滋补脾阴方药直接作用靶标及其治疗MCI的核心靶标，进行基因功能分析与通路分析。

表1 “中药-成分-靶标”基本信息

2 结果

2.1 滋补脾阴方药靶标预测和共性靶标分析

通过筛选，得到滋补脾阴方药成分687种，其中人参的成分数量最多有158种，莲子的成分数量最少仅10种，成分数目及靶标总数目见表1。共性靶标分析显示，滋补脾阴方药中12味中药之间存在协同作用，其中人参、山药、白芍、白扁豆等药物间共性靶标较多，说明这几味中药协同作用较强。共性靶标分析结果见表2。

2.2 滋补脾阴方药治疗MCI的候选靶标基因互作网络分析

以节点连接度的2倍中位数为卡值，构建滋补脾阴方药靶标-MCI基因互作网络关键节点子网见图1；以节点连接度、节点紧密度和节点介度的中位数为卡值，选取滋补脾阴方药治疗MCI网络的候选靶标，共计595个，排名前10见表3，关键靶标对应的化合物及中药来源显示在表4中，并构建“滋补脾阴方药-中药材-化学成分-核心靶标-关键通路”的多层次网络关联图，见图2。

2.3 滋补脾阴方药治疗MCI的关键靶标富集分析

2.3.1 关键靶标的GO富集分析

对滋补脾阴方药直接作用靶标及其治疗MCI的核心靶标进行基因功能分析，根据P值排名前10位展示在表5中。

表2 滋补脾阴方药中单味药材间共有靶标分析结果

图1 滋补脾阴方药靶标-MCI基因互作网络中的核心节点子网

2.3.2 关键靶标的KEGG通路富集分析

对滋补脾阴方药直接作用靶标及其治疗MCI的核心靶标进行通路分析，总共获得190条通路，根据P值排名前10位展示在表6中。

3 讨论

滋补脾阴方药是战丽彬教授在多年临床实践基础上，根据清代·吴澄《不居集》中资成汤化裁而成，由人参，山药，茯苓，白芍等药物组成。全方共奏培补后天、滋补脾阴、活血化痰、安神益智之效。通过对计算得到的滋补脾阴方药与轻度认知功能障碍的相关有效物质进行文献验证，发现人参中的人参皂苷Rb1[9]、Rh1[10]、Rg3[11]、Rg1[12]，白芍中的芍药苷[13]，丹参中的丹参酮[14]、丹参多酚酸[15]，茯苓中的茯苓多糖[16]，远志中的远志皂苷[17]等均有相关文献报道，证明了此研究方法的合理性。共性靶标分析显示，共靶数目较多的有人参-山药290个，人参-白芍103个，人参-白扁豆113个，人参-甘草110个，人参-远志72个，人参-丹参68个，白扁豆-山药109个，说明这些药物之间协同作用较强。而陈皮、檀香、石菖蒲、莲子与其他药物之间的共靶数目较少，说明这些药物协同作用较弱，提示滋补脾阴方药中治疗MCI的核心药物可能是人参、山药、茯苓、白扁豆、白芍、丹参、远志和甘草。

表3 滋补脾阴方药治疗MCI的候选靶标名称及其相关网络拓扑特征参数值

表4 滋补脾阴方药治疗MCI关键靶标对应的化合物、中药来源及所参与主要信号通路

图2 “滋补脾阴方药-中药材-化学成分-核心靶标-关键通路”多层次网络关联

表5 滋补脾阴方药治疗MCI关键靶标GO富集分析结果

通过网络分析，滋补脾阴方药治疗MCI排在前10位的关键靶标有HADHA（羟酰辅酶A脱氢酶三功能多酶复合物亚基α）、HADH（羟酰-CoA脱氢酶）、NSDHL（NAD（P）依赖类固醇脱氢酶样）、PLCD1（1-磷脂酰肌醇4,5-二磷酸磷酸二酯酶δ-1）、ADH1A（乙醇脱氢酶1A）、ALDH3A2（脂肪醛脱氢酶）、GCK（葡萄糖激酶）、ADH1C（乙醇脱氢酶1C）、ENPP1（核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成员1）、ADCY2（腺苷酸环化酶2型）。这些关键靶标主要来源于人参中的三磷酸腺苷、甘露糖、蔗糖、木糖、果糖、甘露糖、甘露糖-b、麦芽糖、腺苷，山药中的植酸、D-甘露糖、D-葡萄糖苷、木糖、半乳糖、3,4,6-Trihydroxyphenanthrene-3-O-β-d-D-吡喃葡萄糖苷，白芍中的1-O-没食子酰基-葡萄糖，远志中的远志糖醇，白扁豆中的水苏糖、麦芽糖、蔗糖，甘草中的异甘草甙、新异甘草甙、甘草酸、甘草皂苷B2、甘草皂苷C2、甘草皂苷D3、甘草皂苷H2、乌拉尔甘草皂甙A、乌拉尔甘草皂甙B，并且可能在滋补脾阴方药防治MCI中发挥重要作用。通过GO富集分析发现，这些关键靶标主要定位于细胞质、线粒体等，常见的分子功能是ATP结合、蛋白结合等，并参与调控三羧酸循环等过程。KEGG通路分析显示这些关键靶标参与嘌呤代谢、核苷酸代谢、碳代谢、碳水化合物代谢等通路。嘌呤代谢通路中的代谢产物尿酸水平与认知障碍密切相关[18]。神经退行性疾病中存在核苷酸代谢障碍[19]。碳代谢中的叶酸和维生素B12通过参与机体细胞生物甲基化和DNA的合成，以及机体奇数链脂肪酸和某些氨基酸的线粒体代谢过程，对神经基因的表达进行调节。若代谢过程受到干扰，就会对机体神经组织造成一定的影响[20]。碳水核苷酸代谢的紊乱化合物是生命细胞结构的主要成分及主要供能物质，并且有调节细胞活动的重要功能。机体中碳水化合物的存在形式主要有三种，葡萄糖、糖原和含糖的复合物。葡萄糖是大脑重要的能量物质，大脑葡萄糖代谢障碍与认知障碍密切相关[21]。上述分析结果与已知文献报道有一定的吻合，说明了TCMIP预测的准确性，为进一步深入阐释滋补脾阴方药的作用机制提供科学依据。

表6 滋补脾阴方药治疗MCI关键靶标KEGG富集分析结果

综上所述，本研究利用整合药理学平台，以中医药大数据为支撑，采用人工智能“数据挖掘”网络科学等学科的方法与技术，多靶点、多方位、多层次地对滋补脾阴方药的活性成分、药物靶点和MCI信号通路进行了探索性研究。研究结果初步验证了滋补脾阴方药防治MCI的物质基础与作用机制，既体现了滋补脾阴方药多成分、多靶点、协同作用的特点，也为进一步深入探讨作用机制奠定了良好基础。整合药理学平台作为一种新兴的中药现代研究手段，还存在一定的局限性，若要将得出的结论应用于临床，仍需体内外实验的验证。同时，本研究未考虑中药的剂量以及煎煮过程中活性成分的变化，因此还需要进一步深入研究探讨。