参麦注射液对重症急性胰腺炎大鼠肠黏膜屏障功能的保护作用

古凌燕，宋振顺

(1.同济大学医学院；2.同济大学附属第十人民医院，上海 200333)

重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)发病急，病情重，并发症多，病死率高，目前病死率仍达10%～30%，胰腺和胰周的继发感染是影响急性胰腺炎死亡率的重要因素[1]。肠屏障功能损伤所引起的早期细菌易位被认为的是胰腺继发感染的重要原因[2]，所以防治肠屏障功能损害导致的细菌及内毒素等肠源性有害物质的移位对阻止SAP发展，改善患者的预后至关重要。

参麦注射液在急性胰腺炎的临床治疗中显示确切的疗效，可缓解患者的临床症状和体征，同时又能降低实验室相关指标[3]，缩短住院时间[4]。在动物实验中发现参麦注射液对SAP模型大鼠多个器官功能均有保护作用[5]，并且在肠系膜血管缺血再灌注大鼠模型中证实了对肠黏膜屏障功能具有保护作用[6]，但目前有关参麦注射液对SAP肠屏障功能是否有保护作用尚不清楚。本实验将应用牛磺胆酸钠建立大鼠SAP模型，应用参麦注射液干预，观察肠道病理变化，通过检测肠道炎症因子、肠道屏障通透性指标、肠道氧化应激指标探讨参麦注射液对SAP肠黏膜屏障功能是否有保护作用及可能的作用机制，为临床治疗SAP伴肠屏障损害、进一步降低感染率、降低死亡率提供新的思路及实验依据。

1 材料与方法

1.1 试剂

参麦注射液购自正大青春宝药业有限公司(国药准字 Z33020020,生产批号1706054 )，牛磺胆酸钠购自美国sigma公司，大鼠血清D-乳酸试剂盒购自美国BioVision公司，大鼠DAO、TNF-ɑ及IL-10 ELISA试剂盒购自美国R&D公司，丙二醛(MDA)及超氧化物岐化酶(SOD)试剂盒购自南京建成生物工程研究所；其余实验室常规试剂购自上海欲立生物科技有限公司。

1.2 动物与分组

6—8周龄清洁级雄性SD大鼠24只，体质量(200±20) g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。按随机数字表法分为假手术组、SAP模型组，参麦注射液治疗组，每组8只。

1.3 造模及给药

采用胰胆管逆行性注入5%牛磺胆酸钠1 mL/kg体质量的方法制备SAP模型。对照组仅开腹翻动十二指肠并触摸胰腺数次后关腹。参麦治疗组制模后30 min参麦组均经尾静脉给予5 mL/kg参麦注射液，对照组和SAP组注射等量生理盐水。

1.4 标本采集

腹腔注射2.5%戊巴比妥钠(2.5 mL/kg)麻醉，于腹主动脉取血，收集血液后以3 500 r/min离心15 min，取上清，将血浆保存于-80 ℃冰箱待测。取2 cm肠段于冻存管中，-80 ℃冰箱冻存，用于制作肠组织匀浆。

1.5 指标检测

1.5.1 大鼠血浆DAO测定 采用ELISA法测定，具体操作按试剂盒说明书进行，使用Bio-rad608酶标仪仪于450 nm处进行吸光度测定，绘制标准曲线，计算出血浆二胺氧化酶DAO的浓度。

1.5.2 大鼠血浆D-乳酸水平测定 采用酶偶联紫外分光光度法检测血清中D-乳酸水平，原理是D-乳酸被D-乳酸脱氢酶特异性氧化，按其比例产生颜色，可在450 nm处检测。具体操作按说明书进行，采用Bio-rad608酶标仪进行测定，绘制标准曲线，计算出D一乳酸浓度。

1.5.3 小肠组织中MDA含量及SOD活性测定 将冻存肠道组织放入EP管，放入9倍生理盐水，用组织匀浆机进行粉碎，将制备好的10%匀浆用低温离心机3 500 r/min左右离心15 min，将离心好的匀浆置入EP管待测。用硫代巴比妥酸比色法测定MDA，用黄嘌呤氧化法测定SOD的活性变化，按测试盒说明书步骤操作。

1.5.4 小肠组织中TNF-ɑ及IL-10的测定 将冻存肠道组织放入EP管，放入9倍生理盐水，用组织匀浆机进行粉碎，将制备好的10%匀浆用低温离心机3 500 r/min左右离心15 min，将离心好的匀浆置入EP管待测。用ELISA法检测TNF-ɑ及IL-10水平，具体操作步骤按说明书进行。采用酶标仪仪于450 nm处进行吸光度测定，绘制标准曲线，计算出TNF-ɑ及IL-10的浓度。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 3组大鼠血清DAO、D-乳酸水平比较

如表1所示，与假手术组相比，SAP组DAO及D-乳酸水平明显增高(P<0.05)；治疗组可明显降低SAP引起的DAO及D-乳酸水平升高(P<0.05)。

表1 3组大鼠血清DAO、D-乳酸水平比较

*P<0.05，与假手术组比较；#P<0.05，与SAP组比较。

2.2 3组大鼠小肠匀浆MDA、SOD水平比较

如表2所示，与假手术组相比，SAP组肠组织MDA含量明显升高(P<0.05)，SOD活性明显降低(P<0.05)；而治疗组可明显降低SAP引起的MDA水平升高(P<0.05)，逆转SOD活性下降(P<0.05)。

表2 3组大鼠小肠匀浆MDA、SOD水平比较

*P<0.05，与假手术组比较；#P<0.05，与SAP组比较。

2.3 3组大鼠小肠匀浆TNF-ɑ、IL-10水平比较

如表3所示，与假手术组相比，SAP组肠组织TNF-ɑ水平明显升高(P<0.05)，IL-10水平明显升高(P<0.05)；而治疗组可明显降低SAP引起的TNF-ɑ水平升高(P<0.05)，并提高IL-10水平(P<0.05)。

表3 3组大鼠小肠匀浆TNF-ɑ、IL-10水平比较

*P<0.05，与假手术组比较；#P<0.05，与SAP组比较。

3 讨论

SAP的高病死率主要因继发急性呼吸功能衰竭、脓毒症以及多器官功能衰竭(MODS)所致[7]。动物实验及临床研究表明，胰腺炎发病后不久便出现肠道通透性的增加，而且肠道屏障功能损伤的程度已被证明与脓毒症、MODS相关[8-9]。DAO是位于肠黏膜上绒毛细胞中高度活性的细胞内酶，尤以空、回肠活性最高。肠黏膜损伤严重时，大量DAO随着坏死脱落的肠黏膜细胞进入肠腔以及释放入血，导致肠黏膜内DAO活性降低，而血和肠腔中DAO活性增高。由于血中DAO活性相对稳定，是反映肠道黏膜上皮细胞完整性的血浆标记物[10]。D-乳酸是肠道多种细菌的代谢产物，正常情况下不被吸收降解，肠黏膜通透性增加时，肠道中大量D-乳酸释放入血，故检测D-乳酸水平可反映肠黏膜损伤程度[11]。本研究发现，SAP组大鼠血DAO活性及D-乳酸水平均较假手术组显著上升，参麦注射液治疗可有效抑制这两个指标的上升，说明参麦注射液治疗对SAP大鼠肠黏膜屏障功能障碍有一定的保护作用。

SAP早期，白细胞的过度激活会引起肿瘤坏死因子、白介素等细胞因子的瀑布样释放，导致严重的黏膜损伤，继而肠黏膜通透性增加导致细菌与内毒素移位，后者又加重这一过程，最终导致MODS[12-13]。在众多炎性因子中TNF-a起关键作用，它可诱导其他细胞因子如IL-1、IL-6等的产生和释放，使炎症信号进一步放大和加强，产生“级联放大”作用，最终导致过重的炎症反应及细胞损害[14-16]。IL-10是一种主要由单核细胞和T淋巴细胞分泌的抗炎介质，能直接或间接抑制其他炎性介质如IL-6、TNF-α等促炎细胞因子的合成与释放，减轻炎症反应的程度；同时也可抑制胰腺炎细胞凋亡，改善胰腺组织微循环，对AP具有良好的保护作用[17]。本实验发现参麦注射液治疗可明显降低小肠组织TNF-α水平，同时提高IL-10水平，有效减轻肠道炎症反应，减轻病理损伤。

研究发现，缺血和缺血/再灌注(I/R)损伤是造成肠道病理学损伤的重要组合因素[18]。由于肠道本身的高代谢及绒毛微血管结构的特性，肠道对灌注不足非常敏感，绒毛顶部黏膜细胞极易发生缺血性损害[19]。而缺血组织再灌注时造成的微血管和实质器官的损伤主要是由活性氧自由基引起的，这已在多种器官中得到的证明。肠黏膜中含有丰富的黄嘌呤氧化酶，当缺血再灌注损伤发生时，肠黏膜细胞发生的氧化应激更为强烈，损伤更加严重。已有研究表明氧自由基可损伤细胞线粒体，导致钙超载,引起细胞内酶的活化，细胞水肿及细胞骨架的破坏，促使细胞凋亡[20]。活性氧和活性氮还能够通过破坏黏液层的黏度，疏水性，破坏肠屏障功能[21]。有研究发现，离体胰腺腺泡细胞在没有炎性因子的环境中，活性氧自由基能够激活核转录因子(NF-κB)，进而促使细胞因子的释放，进一步加重肠黏膜屏障的损害[22]。MDA含量是组织脂质过氧化的一种指标，间接反映细胞损伤程度。SOD是生物抗氧化系统的重要酶类之一，能有效减轻有害氧自由基对细胞的损害，其活力可间接反映组织的抗氧化能力。因此，两者是衡量机体氧化及抗氧化平衡的重要检测指标。本研究发现参麦治疗组可明显降低小肠组织MDA水平，逆转SOD活性下降，表明参麦注射液可能通过抑制氧自由基的产生，对SAP肠道损伤产生保护作用，这与既往报道的参麦注射液具有抗氧化效应相符[6]。

综上所述，参麦注射液可对重症急性胰腺炎导致的肠黏膜功能障碍起保护作用，其机制可能与调节抗炎抑炎因子表达，抑制氧化应激有关。本研究虽表明参麦注射液具有抗炎、抗氧化作用，但其中是否还存在其他作用机制，作用靶点以及信号通路尚不清楚，未来仍需进一步研究。