观察非小细胞肺癌患者循环肿瘤细胞在治疗中的动态变化及与预后相关性的前瞻性研究

黄韵坚　徐海鹏　黄诚

【摘要】 目的：探究非小细胞肺癌患者循环肿瘤细胞在治疗中的动态变化及相关的预后前瞻性研究。方法：选取本院2014年1月-2017年1月收治的200例晚期非小细胞肺癌患者，在给予治疗后，采集患者一线、二线化疗前后外周血，采用多重mRNA原位分析法测定患者治疗前后循环肿瘤细胞（CTC）计数，采用相关性分析软件对CTC细胞数变化与无进展生存期（progression-free survival，PFS）、客观缓解率（objective response rate，ORR）、总生存期（overall survival，OS）的关系进行分析。结果：200例患者治疗后CTC细胞阳性率显著低于治疗前，差异有统计学意义（P<0.05）；同时，患者的CTC表达同OS与ORR均呈负相关（P<0.05）。结论：非小细胞肺癌患者采用一线、二线化疗时通过捕捉检测患者外周血中痕量存在的CTC，采用多重mRNA原位分析法动态监测CTC细胞数，有助于评估临床疗效，且与预后具有相关性，有助于指导临床治疗，可进一步分析研究。

【关键词】 非小细胞肺癌； 循环肿瘤细胞； 动态分析； 相关性

A Prospective Study on the Dynamic Changes in the Treatment of Circulating Tumor Cells in Patients with Non-small Cell Lung Cancer and the Correlation with Prognosis/HUANG Yunjian，XU Haipeng，HUANG Cheng，et al.//Medical Innovation of China，2018，15（14）：037-040

【Abstract】 Objective：To investigate the dynamic changes of circulating tumor cells in patients with non-small cell lung cancer （NSCLC） and to investigate the prognosis of the changes.Method：200 patients with advanced non-small cell lung cancer treated in our hospital from January 2014 to January 2017 were selected.Blood samples were collected before and after the first and second chemotherapy.Determination of circulating tumor cells （CTC） count before and after treatment by multiple mRNA in situ analysis，and correlation analysis software was used to analyze the relationship between CTC cell number and progression-free survival（PFS），objective response rate（ORR），overall survival（OS）.Result：The positive rate of CTC cells in 200 patients after treatment was significantly lower than that before treatment（P<0.05）.Meanwhile，the expression of CTC was negatively correlated with OS and ORR（P<0.05）.Conclusion：Patients with non-small cell lung cancer use the first line and second line chemotherapy to detect the presence of trace CTC in the peripheral blood of the patients，the multiple mRNA in situ analysis is used to dynamically monitor the number of CTC cells，it is helpful to evaluate the clinical effect and be related to the prognosis，which helps to guide the clinical treatment and can be further analyzed.

【Key words】 Nonsmall-cell lung cancer； Circulating tumor cells； Dynamic analysis； Correlation

First-authors address：Fujian Province Tumor Hospital Affiliated to Fujian Medical University，Fuzhou 350014，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.14.009

肺癌是一種临床上常见的恶性肿瘤，近年来随着各种环境因素以及我国人均寿命的延长，我国肺癌发生率也随之上升。其中非小细胞肺癌（NSCLC）占到了肺癌患者的85%左右[1]，并且大多数处于晚期，目前晚期非小细胞肺癌患者死亡率处于我国恶性肿瘤首位，在治疗上，传统的治疗方式主要是化疗[2]，目前随着分子生物技术及药物的发展，出现了靶向治疗与免疫治疗，使晚期肺癌患者的生存期明显延长，在肺癌治疗中，一般采用影像学进行评价，但存在滞后性，并且无法进行生物学特点的检测。循环肿瘤细胞（CTC）泛指存在于人体外周血内各类肿瘤细胞的总称，此类细胞多由于自发性或诊疗性操作使其在原有实体病灶中脱落，而后进入人体外周血中，多数自行凋亡，仅少数进展为转移灶，对患者生命安全存在严重威胁。CTC能够准确反映患者的肿瘤基因信息，通过监测患者的CTC类型与数量可了解其肿瘤病灶动态变化情况，并且有助于评估治疗效果，辅助开展个体性治疗方案。同时，临床检测CTC具有良好的简便性，并且能够持续进行动态检测，从而实时给予反馈辅助医师及时给予治疗策略改变，更有助于提升临床治疗效果，延长患者生存时间。既往研究发现，将CTC用于肺癌患者治疗评估中效果理想，有助于评估患者预后并指导临床治疗，但不同的研究采用不同的方法界定CTC，且样本量偏少。本次研究本院主要对NSCLC患者治疗中循环肿瘤细胞动态变化做了记录分析，同时探讨了CTC同无进展生存期（progression-free survival，PFS）、客观缓解率（objective response rate，ORR）、总生存期（overall survival，OS）的关系，具体报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 将本院2014年1月-2017年1月收治的200例晚期非小细胞肺癌患者作为研究对象。纳入标准：所有患者经检查均确诊为晚期非小细胞肺癌患者；年龄均≥18岁[3]。排除标准：妊娠或处于哺乳期的患者；研究期间不采取避孕措施的育龄患者；可通过血液等方式传播免疫缺陷病毒的患者[4]。其中男126例，女74例，年龄39～82岁，平均（62.8±10.2）岁；120例患者有吸烟史，80例患者无吸烟史；TNM分期：ⅢB期62例，Ⅳ期138例；病理类型：腺癌110例，鳞癌90例；ECOG评分：0分128例，1分72例；远处转移数目：62例无转移，60例有1处转移，28例有2处转移，50例有2处以上转移。本研究已经医院伦理委员会批准通过，所有患者均签署了本研究的知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 治疗方法 所有患者治疗前均进行心电图、血常规、肿瘤标志物及胸腹CT等检查[5]。根据患者病情医生选择药物化疗。化疗方案为：一线化疗使用顺铂或卡铂联合紫杉醇、培美曲塞、吉西他滨和多西紫杉醇进行；二线化疗使用多西紫杉醇或培美曲塞单种药物进行[6-7]。以上化疗均3周为1个周期，需化疗4～6个周期，并给予随访。

1.2.2 检测方法 样本采集：采集一线/二线化疗前后外周血，化疗前3 d进行第一次血液采集，且将其定为基线，第二周期化疗前3 d进行第二次采集，第三周期化疗前3 d进行第三次采集，若化疗过程中进展，则进行采血（第四次）；入组后6个月未见进展则终止采血[8]。CTC检测：应用广州益善生物医药科技公司开发的CanPatrolTM方法（多重mRNA原位分析法），采用人外周血非血源细胞分型检测试剂盒（多重mRNA原位分析法）开展CTC检测。首先，提取患者外周血5 mL，对标本进行裂解红细胞，再由纳米过滤技术截留CTC，通过多重RNA原位分析与扫描获得最终检测结果[9-10]。检测所应用核酸探针及其序列，见表1。检验后由2名检验医师评定CTC计数，其中阳性表示CTC计数>2，阴性表示CTC计数等于1。

1.3 观察指标 （1）CTC细胞数量：测量并记录肺癌患者治疗前后的CTC细胞数量（CTC计数由广州益善生物医药科技有限公司所研发的诊断系统进行记录）[11]。（2）相关性分析：分析治疗前后CTC计数变化及其与PFS、ORR、OS的关系。CTC与PFS、ORR、OS的相关性采用Spearmans rank系数分析[12-13]。

1.4 统计学处理 数据应用SPSS 18.0进行分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验；计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验，相关性分析应用Spearmans rank系数，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 200例患者治疗前后的CTC阳性率比较 200例患者治疗后CTC细胞阳性率为42.5%（85/200），明显低于治疗前的71.0%（142/200），差异有统计学意义（字2=6.463，P<0.05）。

2.2 患者CTC和ORR、OS的相关性分析 由Spearmans rank系数对比，患者CTC与PFS、ORR及OS均存在负相关（P<0.05），见表2。随着总生存率的不断降低，CTC阴性率和阳性率均呈现降低趋势，见图1。随着客观缓解率的升高，CTC阴性率和阳性率均呈现升高趋势，见图2。

3 讨论

本次研究通过对200例非小细胞肺癌患者开展CTC检测发现，治疗前CTC阳性共142例，阳性率为71.0%；治疗后CTC阳性85例，阳性率为42.5%，治疗后CTC阳性率明显降低，表现其化疗方案有助于抑制CTC表达，而CTC表达情况也能对临床治疗起到辅助作用。同时，本研究结果显示，患者的CTC表达同期PFS、ORR与OS存在密切相关性，CTC阳性患者的OS明显短于阴性患者，并且CTC阳性患者的ORR明显低于阴性患者，表现出CTC表达对患者的预后情况有良好预估效果。Mokhles等[14]主要分析了Ⅲ期和Ⅳ期患者一个周期化疗前后的CTCs数据，得出肺癌分期和CTCs之间存在一定关系，Ⅳ期患者检测出的CTCs明显多于Ⅲ期患者；另外，经多因素分析表明CTCs与PFS、OS和ORR存在一定相关性[15-17]。陈昌南等[15]研究结果中也表明了CTCs的数量变化与CT检查结果相同，提示可根据CTCs数量变化进行病情诊断。以上研究均与本研究结果一致。CTCs的研究依赖于CTC-Chip技术，其原理主要是将肿瘤细胞的EpCAM作为靶抗原，从而设计相对应的抗体，达到捕获CTC的目的[16-17]。而肿瘤细胞在其生长发展过程中会发生上皮-间质转化（EMT），所以CTC-Chip在捕获CTC过程中出现遗漏，从而降低结果的准确性，另外有大量研究表明，CTC-Chip技术捕获效率较低，对非小细胞肺癌的捕获率仅25%左右[18-19]。为了避免上皮标志物鉴别法带来的局限性，因此，本次研究笔者采用的是多重mRNA原位分析法来捕获CTC细胞，采用多重RNA探针，分别针对多种CTC特异性基因，来捕捉CTC细胞。CanPatrolTM系统的检测技术是目前唯一可以同步实现CTC形态分型、细胞分型以及分子分型的方法，通过纳米过滤技术来富集CTC，而不需要依賴特异生物标志物（如EpCAM），进而减少非小细胞肺癌患者CTC细胞的丢失，具有可重复性、高特异性、高灵敏度等优点[20]。这同以往的CTC-Chip技术不同，这是基于分子水平上的检测，相比较而言结果准确。

综上所述，非小细胞肺癌患者采用一线、二线化疗时动态监测CTC细胞数有助于评估临床疗效，且与预后具有相关性，有助于指导临床治疗，值得推广应用。

参考文献

[1]涂长玲，朱颖，董坚，等.晚期非小细胞肺癌循环肿瘤细胞EGFR表达与细胞免疫的相关性研究[J].西部医学，2016，28（9）：1221-1226.