武当地区马尾松松针中总黄酮及莽草酸含量测定

柯昌虎　郑芳　严慧

摘要：目的 建立武当地区马尾松松针中总黄酮及莽草酸含量测定方法。方法 采用紫外分光光度法，以芦丁为对照品，在波长500 nm处测定总黄酮的含量。采用HPLC测定莽草酸含量，色谱柱为Fortis Xi C8柱（5 ?m，250 mm×4.6 mm），流动相为乙腈-0.4%磷酸溶液（8∶92，V/V），流速为0.9 mL/min，检测波长为213 nm，柱温为30 ℃，进样量为20 ?L。结果 芦丁在8.26～49.54 ?g范围内与吸光度呈良好的线性关系（r=0.999 4），平均加样回收率为99.2%，RSD=1.94%。莽草酸在10.26～61.56 ?g范围内与峰面积呈良好的线性关系（r=0.999 4），平均加样回收率为99.5%，RSD=1.93%。马尾松松针中总黄酮含量为28.33 mg/g，莽草酸含量为15.25 mg/g。结论 本方法简便、快速、准确、重复性好，可作为武当地区马尾松松针中总黄酮及莽草酸的含量测定方法。

关键词：马尾松；松针；总黄酮；莽草酸；含量测定；紫外分光光度法；高效液相色谱法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.06.017

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）06-0069-04

Content Determination of Total Flavonoids and Shikimic Acid in Pine Needles of

Pinus massoniana Lamb. in Wudang Area

KE Chang-hu1， ZHENG Fang1， YAN Hui1， LIU Hui-min1， FU Pei-hu1， HU Ping2， ZHU Xue-song1

1. Dongfeng Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine， Shiyan 442000， China；

2. College of Pharmacy， Hubei University of Medicine， Shiyan 442000， China

Abstract： Objective To establish a method to determine the contents of total flavonoids and shikimic acid in pine needles of Pinus massoniana Lamb. in Wudang Area. Methods Rutin was used as reference standard， and the content of total flavonoids in pine needles of Pinus massoniana Lamb. was determined by UV spectrometry at wavelength of 500 nm. The content of shikimic acid was determined by HPLC-DAD. The Fortis Xi C8 column （5 ?m， 250 mm × 4.6 mm） was adopted with acetonitrile - 0.4% phosphoric acid solution （8：92， V/V） as mobile phase at the flow rate of 0.9 mL/min. The detection wavelength was 213 nm； the column temperature was 30 ℃； the injection volume was 20 ?L. Results The linear range was 8.26–49.54 ?g for rutin （r=0.999 4） with an average recovery of 99.2%， RSD=1.94%. The linear range was 10.26–61.56 ?g for shikimic acid （r=0.999 4） with an average recovery of 99.5%， RSD=1.93%. The contents of total flavonoids in pine needles of Pinus massoniana Lamb. was 28.33 mg/g， and shikimic acid was 15.25 mg/g， respectively. Conclusion The method is simple， rapid， accurate and reproducible. It can be used for the content determination of total flavonoids and shikimic acid in pine needles of Pinus massoniana Lamb. in Wudang Area.

Keywords： Pinus massoniana Lamb.； pine needles； total flavonoids； shikimic acid； content determination； UV spectrometry； HPLC

武當马尾松Pinus massoniana Lamb.为松科松属植物，大面积分布于武当山系海拔800 m以下亚热带落叶常绿阔叶混交林带。松针为马尾松的针状叶，是马尾松的药用代表部位[1]。松针中含有黄酮、挥发油、莽草酸等活性成分[2-4]。黄酮类化合物具有抗氧化、抗病毒、抗癌、降血脂等药理作用[5-6]。莽草酸在松针中含量丰富，具有抗血小板聚集、抗菌、镇痛、预防血栓等药理作用[3，7]，同时作为药物中间体用于合成抗流感及抗癌类药物，使开发松针资源具有较高的药用价值和经济价值。本课题组前期对松针及“武当松针茶”进行研究，初步分析了多种药用成分[8-11]。本研究通过充分提取松针中主要活性成分总黄酮和莽草酸并测定其含量，为马尾松松针资源利用及开发松针类药品、食品、保健品、添加剂等提供参考。

1 仪器与试药

SP-752紫外分光光度计，上海光谱仪器有限公司；UltiMate 3000高效液相色谱仪，戴安（中国）有限公司；电子分析天平，德国METTLER TOLEDO公司；KQ-500DE数控超声波清洗器，上海书培实验设备有限公司；TG16G高速离心机，盐城市凯特实验仪器有限公司；FW100高速万能粉碎机，苏州江东精密仪器有限公司。

芦丁对照品（批号13051116，纯度≥98%），成都普瑞法科技开发有限公司；莽草酸对照品（批号100081-200907），中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈为色谱纯；水为自制纯化水；其他试剂为分析纯。

马尾松松针于2017年1月6日采自湖北省赛武当风景区，原植物标本经湖北医药学院陈吉炎教授鉴定为马尾松Pinus massoniana Lamb.的针叶。

2 方法与结果

2.1 样品预处理

将新采的马尾松松针（批号20170106）用清水洗净后置于（41±1）℃干燥箱中约30 h，粉碎、过筛（60目），经石油醚（30～60 ℃）脱脂后置阴凉通风处至干，制得松针干燥粉末，密闭保存，备用。

2.2 总黄酮含量测定

2.2.1 对照品溶液的制备

精密称取芦丁对照品适量，用适量甲醇溶解并定容，使芦丁对照品贮备液浓度为1.032 mg/mL。取上述贮备液适量，用水稀释成浓度为0.206 4 mg/mL芦丁对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备

取“2.1”项下松针干燥粉末约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇100 mL，称定质量，超声处理（功率350 W，温度60 ℃±2 ℃，频率40 kHz）45 min，放冷，再称定质量，用70%乙醇补足减失的质量，摇匀，10 000 r/min离心8 min，取上清液，即得。

2.2.3 线性关系考察

取芦丁对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL分别置于25 mL量瓶中，各加水至6.0 mL，加5% NaNO2溶液1 mL，混匀，放置6 min，加10%Al（NO3）3溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加4%NaOH试液10 mL，再加水至刻度，摇匀，放置15 min，以相应的试剂为空白，用紫外-可见分光光度法，在500 nm波长处测定吸光度[12-13]，以芦丁含量（?g）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y=0.012X-0.006 5（r=0.999 4），结果表明，芦丁含量在8.26～49.54 ?g范围内线性关系良好。

2.2.4 精密度试验

取“2.2.1”项下芦丁对照品溶液4.0 mL，共6份，分别置于25 mL量瓶中，各加水至6.0 mL，按“2.2.3”项下方法测定吸光度，结果RSD=0.93%，表明仪器精密度良好。

2.2.5 稳定性试验

取“2.1”项下松针干燥粉末，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，显色后分别于0、10、20、30、40、50、60 min进行测定，结果RSD=1.12%，表明样品稳定可靠。

2.2.6 重复性试验

取松针干燥粉末，共6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2.3”项下方法测定吸光度，计算总黄酮含量，结果RSD=1.58%，表明该方法具有较好的重复性。

2.2.7 加样回收率试验

取同一批号松针干燥粉末（总黄酮含量28.33 mg/g）约0.15 g，共6份，分别置于具塞锥形瓶中，各加入“2.2.1”项下芦丁对照品贮备液4.0 mL，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.3”项下方法进行测定，计算加样回收率，结果见表1。

2.2.8 样品含量测定

取松针干燥粉末约0.5 g，共3份，分别制备供试品溶液，进样分析，并计算总黄酮含量。结果3批样品中总黄酮的含量分别为28.34、28.25、28.40 mg/g，平均含量为28.33 mg/g。

2.3 莽草酸含量测定

2.3.1 对照品溶液的制备

取莽草酸对照品适量，用水溶解后定容，制成莽草酸对照品贮备液（浓度1.026 mg/mL）。取上述对照品贮备液适量，用水稀释成莽草酸对照品溶液（浓度20.52 ?g/mL）。

2.3.2 供试品溶液的制备

取“2.1”項下松针干燥粉末约0.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入100 mL水，称定质量，超声处理（功率500 W，温度40 ℃±2 ℃，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用水补足减失的质量，摇匀，10 000 r/min离心8 min，取上清液，用0.22 ?m滤膜过滤，取续滤液，即得马尾松松针供试品溶液。

2.3.3 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Fortis Xi C8柱（250 mm×4.60 mm，5 ?m）；流动相：乙腈-0.4 %磷酸水溶液（8∶92，V/V）；流速：0.9 mL/min；检测波长：213 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 ?L。

在上述色谱条件下，分别取“2.3.1”项下对照品溶液和“2.3.2”项下供试品溶液进样分析，色谱图见图1。测得莽草酸的保留时间tR约为5.5 min，其理论塔板数不低于4000，供试品色谱峰的DAD匹配值不低于999.88，表明供试品溶液中莽草酸的色谱峰与相邻杂质的色谱峰达到了基线分离。

2.3.4 线性关系考察

精密吸取莽草酸对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，按“2.3.3”项下色谱条件依次进样分析。以峰面积积分值为纵坐标，对照品进样量为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y=2.245 3X+0.986 7（r=0.999 4），结果表明莽草酸进样量在10.26～61.56 ?g范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.3.5 精密度试验

取对照品溶液重复进样6次，记录峰面积，结果莽草酸峰面积的RSD=0.65%，表明精密度满足要求。

2.3.6 稳定性试验

取“2.1”项下松针干燥粉末1份，按“2.3.2”项下的方法制备供试品溶液，分别每隔2 h进样1次，共进样7次，结果莽草酸峰面积的RSD=1.15%，表明稳定性良好。

2.3.7 重复性试验

取“2.1”项下松针干燥粉末6份，制备成供试品溶液，按“2.3.3”项下的色谱条件分别进样，测得莽草酸平均含量为15.25 mg/g，RSD=1.53%，表明重复性良好。

2.3.8 加样回收率试验

取“2.1”项下已知含量的松针干燥粉末（莽草酸含量15.25 mg/g）约0.1 g，共6份，分别加入莽草酸对照品贮备液（浓度1.026 mg/mL）1.5 mL，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.3”项下条件进样分析，计算回收率，结果见表2。

2.3.9 样品含量测定

取松针干燥粉末各3份，制备供试品溶液，进样分析，并计算莽草酸含量。结果3份样品中的莽草酸含量分别为15.25、15.18、15.32 mg/g，平均含量为15.25 mg/g。

3 讨论

本研究采用单因素试验优化马尾松松针中总黄酮和莽草酸的超声提取条件，包括溶剂类型、料液比、超声功率、超声温度、超声时间。在上述单因素试验基础上设计正交试验，优化总黄酮和莽草酸的提取条件。结果总黄酮的优化提取条件为：提取溶剂为70%乙醇，超声功率350 W，时间45 min，温度60 ℃，料液比为1∶200；莽草酸的优化提取条件为：提取溶剂为水，超声功率500 W，时间30 min，温度40 ℃，料液比为1∶400。

本试验总黄酮的含量测定参考2015年版《中华人民共和国药典》，以芦丁为对照品，采用NaNO2- A1（NO3）3-NaOH比色法测定总黄酮的含量。据此原理，结构中含有3'，4'-邻二羟基的原儿茶酸、咖啡酸、绿原酸等非黄酮类物质也能发生显色反应，样品中含有上述成分将会干扰测定结果。课题组前期采用HPLC-DAD对马尾松不同部位有效成分进行了分离试验，在分离出的色谱峰中未检测到原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸色谱峰，初步说明马尾松松针中不含这3种物质或含量未达到仪器最低检测限，从而排除原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸对试验的干扰，增强了该试验的可靠性。

莽草酸的含量测定中，在200～400 nm波长范围内，由Ultimate 3000高效液相色谱仪对莽草酸对照品溶液色谱峰紫外扫描图谱确定检测波长为213 nm，此处莽草酸有最大吸收。本试验比较了Phenomenex C18柱和Fortis Xi C8柱，结果后者分离效果高于前者，Fortis Xi C8柱更适合分离极性较大的莽草酸。

本课题组采用超声法对马尾松松针中总黄酮和莽草酸的提取条件进行了考察，测得总黄酮的最高含量为2.84%，低于前期试验结果（3.76%）[9]，测得莽草酸的最高含量为1.53%，也明显低于文献报道的含量[14-15]。笔者认为造成以上含量差异的原因，一是松针采集时期不同，本研究样品采集时间是1月初，前期试验样品采于4月底，所测结果与文献报道相一致[16]；二是提取方式及条件不同，本研究采用常规超声法进行提取；三是松针产地不同。

马尾松喜光、耐干旱瘠薄，在山脊地带组成纯林，而武当地区独特的山岳自然条件使马尾松天然更新良好，且松针一年四季均可采摘，资源丰富，药用价值和经济价值高，开发前景极其广阔。本课题组的研究结果为马尾松松针资源开发和利用提供了方法学和试验数据依据。后期试验将综合考察不同采收季节的马尾松松针中总黄酮和莽草酸的含量差异及变化趋势，从而为武当地区马尾松资源的合理持续利用提供依据。

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（收稿日期：2017-11-24）

（修回日期：2017-12-11；编辑：陈静）