HHIP基因多态性与新疆蒙古族慢性阻塞性肺疾病易感性的关系研究

马程远，关键，张中宏，梁文晋，任侠，王耀林

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是呼吸系统的一种多发病与常见病，其特征性表现为持续性呼吸道症状、气流受限；通常气流受限由有毒颗粒或气体导致的气道、肺泡异常所引起。目前COPD的确切发病机制尚不明确。但导致COPD发生的危险因素主要为环境因素与遗传因素，两者相互作用。环境因素包括吸烟、生物燃料烟雾、空气污染、职业性暴露等。而遗传因素也是COPD发生、发展重要的内在原因。CHO等［1］进行全基因组关联分析研究（GWAS）发现HHIP、FAM13A、CHRNA3、RIN3、MMP12、TGFB2基因与COPD有相关性。WANG等［2］发现HHIP基因rs12504628位点与COPD患者第1 秒用力呼气末容积/用力肺活量比值（FEV1/FVC）具有相关性，提示在中国汉族人群中HHIP基因与COPD易感性相关。新疆聚居着维吾尔族、哈萨克族、蒙古族、柯尔克孜族等47个民族，而COPD也是新疆常见疾病。HHIP基因多态性和新疆蒙古族COPD易感性是否存在相关性尚未得知。因此，本研究分析新疆蒙古族的COPD患者和健康志愿者的HHIP基因rs1489758、rs1492820位点基因频率，探讨HHIP基因多态性和新疆蒙古族COPD易感性之间的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2016年1月—2017年6月新疆巴音郭楞蒙古自治州医院和新疆博尔塔拉蒙古自治州医院诊断为COPD的蒙古族患者259例（病例组），男186例，女73例；平均年龄（69.2±10.5）岁。COPD诊断标准：依据《慢性阻塞性肺疾病诊治指南（2013年修订版）》［3］中的诊断标准，有吸烟、环境污染等高危因素接触史，临床症状：咳嗽、咳痰、气喘2年以上，每年持续3个月以上，需行肺功能检查；使用支气管扩张药物后，FEV1/FVC＜70%。选取同期体检中心的体检健康的蒙古族志愿者245例（对照组），男160例，女85例；平均年龄（67.6±9.8）岁。对照组纳入标准：无长期咳嗽、咳痰、气喘病史，肺功能正常（FEV1/FVC≥70%）。排除支气管扩张、支气管哮喘、肺结核、肺癌、肺栓塞等呼吸系统疾病。两组性别、年龄比较，差异无统计学意义（χ2=2.48，t=1.77；P=0.12、0.08）。本研究经石河子大学医学院第一附属医院伦理委员会批准，研究对象均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 肺功能测定 研究对象统一使用全自动肺功能测定仪（美国Medgraphics公司），由统一规范培训的医务人员进行检测。首先将基本资料（如姓名、年龄、性别、身高、体质量、人种等）输入肺功能测定仪，测定研究对象的FEV1占预计值百分比（FEV1%）、FVC及FEV1/FVC，连续重复检测3次（期间每次间隔休息1 min），选取最大的结果记录。

1.2.2 DNA提取 患者均抽取外周静脉血3 ml，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝混匀，-80 ℃保存。采用天根生化科技（北京）有限公司提供试剂盒（离心柱型）提取DNA，按照试剂盒说明书进行操作。应用NanoDrop-2000核酸蛋白测序仪测试DNA浓度及纯度。

1.2.3 基因多态性检测 （1）引物设计：根据GenBank提供的基因序列，应用Primer 4软件对引物进行设计，上述过程由上海天昊生物科技有限公司完成。rs1489758位点引物序列F5'-TTACACTTGCCGAGGCCATATTC-3'，R3'-GAAGGCACCAACGAGGAGTTTG-5'；rs1492820 位 点引 物 序 列F5'-CCTGCCATGAAGTCCCAATGAG-3'，R3'-GCTGCTCACTGAATTTTTCCTGGT-5'。2个 位 点扩增长度分别为349 、285 bp。（2）聚合酶链式反应（PCR）扩增：PCR反应体系（10 μl）包含1×GC-I buffer（Takara.），0.3 mmol/L dNTP，3.0 mmol/L Mg2+，1 U HotStarTaq polymerase（Qiagen Inc.），1 μl样 本DNA和1 μl多重PCR引物。PCR反应条件：预变性95 ℃2 min。以下过程循环11次：变性94 ℃ 20 s，退火65℃ 40 s，延伸72 ℃ 1.5 min，循环每次降低0.5 ℃。以下过程循环24次：变性94 ℃ 20 s，退火59 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 1.5 min。延伸 72 ℃ 2 min，4 ℃保存。（3）PCR产物纯化：在10 μl PCR产物加5 U SAP酶、2 U Exonuclease I酶，37 ℃温浴1 h，75 ℃灭活15 min。（4）延伸反应：延伸反应体系（10 μl）包含5 μl SNaPshot Multiplex Kit（ABI），2 μl纯化多重PCR产物，1 μl延伸引物混合物，2 μl超纯水。延伸引物浓度：2个位点均为1.6 μmol/L。延伸过程：变性96 ℃ 1 min；以下过程循环28次：变性96 ℃ 10 s，退火55 ℃ 5 s，延伸60 ℃ 30 s，4 ℃保存。（5）延伸产物纯化：10 μl延伸产物中加入1 U SAP酶，37 ℃温浴1 h，75 ℃灭活15 min。（6）延伸产物上ABI3730XL测序仪：取0.5 μl纯化后延伸产物，0.5μl Liz120 SIZE STANDARD，9 μl Hi-Di混匀，95 ℃变性5 min上ABI3730XL测序仪，采 用 GeneMapper 4.1（AppliedBiosystems Co.，Ltd.，USA）分析数据。

1.3 统计学方法 采用SPSS 24.0软件进行统计学分析。计量资料以（）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较用单因素方差分析；计数资料比较采用χ2检验；遗传平衡检验采用Hardy-Weinberg平衡检验；采用Logistic回归分析COPD的影响因素。以p＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg平衡检验 HHIP基因rs1489758、rs1492820位点单核苷酸多态性（SNP）分型结果：病例组259例，rs1489758位点分型失败16例，rs1492820位点分型失败15例；对照组245例，rs1489758、rs1492820位点分型失败各1例。rs1489758、rs1492820位点基因型分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡（χ2=2.24、0.61，P=0.13、0.43）。

2.2 病例组HHIP基因rs1489758、rs1492820位点不同基因型患者的肺功能比较 HHIP基因rs1489758、rs1492820位点不同基因型患者的FEV1%比较，差异有 统 计 学 意 义（p＜0.05）。HHIP基 因 rs1489758、rs1492820位点不同基因型患者的FEV1/FVC比较，差异无统计学意义（P＞0.05，见表1、2）。

表1 病例组HHIP基因rs1489758位点不同基因型患者的肺功能比较（，%）Table 1 Comparison of pulmonary function parameters in patients in the case group by the genotype of rs1489758 at the HHIP gene locus

表1 病例组HHIP基因rs1489758位点不同基因型患者的肺功能比较（，%）Table 1 Comparison of pulmonary function parameters in patients in the case group by the genotype of rs1489758 at the HHIP gene locus

注：FEV1%=第1 秒用力呼气末容积占预计值百分比，FEV1/FVC=第1 秒用力呼气末容积与用力肺活量比值

基因型 例数 FEV1% FEV1/FVC GG 171 60.1±8.7 57.0±5.8 GT 67 59.1±8.1 57.7±4.4 TT 5 49.5±5.5 56.5±3.6 F值 4.71 0.47 P值 0.01 0.62

表2 病例组HHIP基因rs1492820位点不同基因型患者的肺功能比较（，%）Table 2 Comparison of pulmonary function parameters in patients in the case group by the genotype of rs1492820 at the HHIP gene locus

表2 病例组HHIP基因rs1492820位点不同基因型患者的肺功能比较（，%）Table 2 Comparison of pulmonary function parameters in patients in the case group by the genotype of rs1492820 at the HHIP gene locus

基因型 例数 FEV1% FEV1/FVC AA 67 57.8±9.3 57.1±6.2 AG 127 60.5±7.6 57.4±5.1 GG 50 58.7±9.6 56.8±5.3 F值 3.13 0.26 P值 0.04 0.77

2.3 HHIP基因rs1489758、rs1492820位点基因型与等位基因分布比较 病例组与对照组HHIP基因rs1489758、rs1492820位点基因型、等位基因分布比较，差异有统计学意义（p＜0.05，见表3、4）。

表3 HHIP基因rs1489758位点基因型、等位基因分布比较〔n（%）〕Table 3 Comparison of patterns of genotype and allele frequencies of rs1489758 at the HHIP gene locus

2.4 COPD影响因素的Logistic回归分析 以是否患COPD（否=0，是 =1）为因变量，以rs1489758位点多态性（赋值：GG=0，GT=1，TT=2；G=0，T=1）、rs1492820位点多态性（赋值：AA=0，AG=1，GG=2；A=0，G=1）为自变量，进行Logistic回归分析，结果显示，rs1489758位点基因型GT、等位基因T和rs1492820位点基因型GG、等位基因G是发生COPD的影响因素（p＜0.05，见表 5）。

表4 HHIP基因rs1492820位点基因型、等位基因分布比较〔n（%）〕Table 4 Comparison of patterns of genotype and allele frequencies of rs1492820 at the HHIP gene locus

表5 COPD影响因素的Logistic回归分析Table 5 Logistic regression analysis of COPD

3 讨论

近年研究发现，HHIP基因是COPD的保护性基因，该基因缺失将增加COPD的风险［4］。典型Hedgehog（Hh）信号通路由成熟的Hh配基激活的Hh信号肽（SHh、IHh、DHh）-膜 蛋 白 受 体 PTCH（PTCH1、PTCH2）-跨膜蛋白SMO-融合阻抑蛋白SUFU-核转录因子Gli（Gli1、Gli2、Gli3）构成。脊椎动物细胞中，无Hh配基时，PTCH阻止SMO转移至纤毛，抑制SMO活性，SUFU与Gli2/3A形成抑制复合物，Gli2/3A被水解成具有抑制形式的Gli2/3R，抑制下游基因表达。而成熟的Hh配基和PTCH结合后，解除PTCH对SMO的抑制，SMO则转移到纤毛上，使Gli2/3A从抑制复合物上解离，激活下游基因的表达。研究显示，异常Hh信号通路会导致肿瘤发生、发展，肺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌等的SHh或IHh转录上调［5］。研究发现Hh配基高表达对Hh信号通路过度异常激活同样会造成COPD的发生、发展［6］。HHIP基因可以与PTCH竞争结合Hh配基，负反馈调节Hh信号通路。

近年HHIP基因已成为研究热点。许多国家对不同种族HHIP基因与COPD关系进行了研究。波兰315例COPD患者与330例吸烟者对照发现HHIP基因rs1542725位点多态性可增加COPD发病［7］。挪威PILLAI等［8］对823例COPD患者与810例吸烟者对照发现了HHIP基因rs13118928位点与肺功能FEV1%有关。中国WANG等［2］对680例COPD患者和687例健康对照者研究，发现HHIP基因rs12504628位点和FEV1/FVC有相关性。成芳娟等［9］对HHIP基因多态性与新疆哈萨克族COPD易感性进行研究，结果显示rs13118928、rs1828591位点与新疆哈萨克族COPD易感性无相关性。任侠等［10］对HHIP基因多态性与新疆维吾尔族COPD易感性进行研究，结果显示rs1828591、rs12504628位点基因型与FEV1%有关。本研究采用SNaPshot分型技术检测新疆蒙古族259例COPD患者与245例健康志愿者，结果显示HHIP基因rs1489758、rs1492820位点与COPD易感性有关。病例组HHIP基因rs1489758位点基因型GT、等位基因T低于对照组，可能降低发生COPD的风险。病例组HHIP基因rs1492820位点不同基因型GG、等位基因G分布高于对照组，可能增加发生COPD的风险。HHIP基因rs1489758、rs1492820位点基因型与FEV1%有关。上述国内外研究得出部分HHIP基因SNP位点与COPD易感性相关，但同一有关联位点的SNP在不同国家、不同民族的结果不尽相同［2，7-10］。

HHIP基因SNP位点众多，本研究根据GWAS选取了其中的2个（rs1489758、rs1492820），而HHIP基因其他位点与新疆蒙古族COPD易感性的关系未见报道，其关系尚不清楚。新疆地广人稀，交通不便，对样本收集造成影响，导致总样本量较少，无法更好阐释HHIP基因SNP与全部新疆蒙古族COPD易感性关系。

综上所述，HHIP基因rs1489758、rs1492820位点多态性可能与新疆蒙古族COPD的发生有关。但今后还需要大样本、多国家、多民族的病例对照研究，形成更完整的信息数据库，更全面揭示HHIP基因多态性和COPD易感性的关系，为未来治疗COPD提供新的方向。

作者贡献：马程远进行文章的构思与设计、研究的实施与可行性分析、数据收集与整理、统计学处理、结果的分析与解释、撰写论文、论文修订；关键进行研究的实施与可行性分析、论文修订，负责文章的质量控制及审校，对文章整体负责，监督管理；张中宏、梁文晋、任侠进行研究的实施与可行性分析、数据收集与整理、统计学处理；王耀林进行数据收集。

本文无利益冲突。