Nrf2、Keap1蛋白在104例肺腺癌中的表达及其临床病理特征

肖宇 朱翔 顾阳春 陈森 梁莉 曹宝山

肺癌目前是世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤[1]，其中80%为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC），约75%的NSCLC就诊时已属于中晚期[2,3]。肺腺癌是NSCLC中最常见的一种病理类型，发现时亦多处于中晚期，药物治疗仍是其主要的治疗手段。尽管近年来随着对表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）基因功能的深入认识，EGFR酪氨酸激酶抑制剂（EGFR tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs）给EGFR突变肺腺癌带来了生存和生活质量的显著改善[4-7]，但不论是化疗，还是EGFR-TKIs，耐药仍是临床上亟待解决的问题。因此，探索药物疗效预测相关的分子指标是目前研究热点之一，这将有助于提高药物疗效、降低药物毒性，改善患者生活质量、减轻患者经济和心理压力。

核因子E2相关因子2［nuclear factor-erythroid 2(NF-E2) p45-related factor 2, Nrf2］/Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1（Kelch-like ECH-associated protein 1, Keap1）是细胞应对氧化应激和亲电性应激损伤的重要防御通路[8,9]。生理状况下，Keap1结合Nrf2，并与E3泛素化连接酶结合，通过泛素化介导Nrf2蛋白降解，维持细胞浆内Nrf2较低水平。一旦细胞处于氧化应激或亲电应激状态，Keap1成为敏感的传感器，通过对自身半胱氨酸残基的修饰，阻止Nrf2降解，并促进Nrf2释放。累积的Nrf2进入细胞核内，激活抗氧化反应元件（antioxidant response element, ARE），进而激活ARE驱动的II相药物代谢酶和抗氧化基因以及部分III相药物转运蛋白表达，从而保护细胞免受氧化应激或亲电应激损伤[8,9]。Nrf2/Keap1信号的异常激活不但参与肿瘤的发生、发展和转移[10-12]，而且还影响化疗药物[9,12,13]和EGFR-TKIs的疗效[14,15]，Krall等在含有驱动基因的肺腺癌细胞中发现Keap1功能缺失会导致多种靶向药物耐药[16]。我们前期研究表明Keap1高表达者铂类药的疗效会减低[17]，EGFR突变患者中Nrf2高表达者EGFR-TKIs的疗效也出现降低[14]。因此，Nrf2/Keap1通路已成为肺癌预防和治疗的潜在靶点[18]，但Nrf2、Keap1在不同驱动基因肺腺癌患者中的表达情况和对相应治疗的影响，尚缺乏此方面报道。

本研究回顾性分析了2010年6月-2012年12月在北京大学第三医院接受过EGFR基因突变检测的肺腺癌患者104例，通过免疫组化方法，确定Nrf2、Keap1在EGFR突变型和野生型肺癌患者中的表达情况及其临床病理特征，并分析Nrf2、Keap1表达水平对EGFR-TKIs疗效的影响。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2010年6月-2012年12月在北京大学第三医院接受过EGFR基因突变检测［通过扩增阻滞突变系统（amplification refractory mutation system, ARMS）或直接测序法］的肺癌患者。入组标准：组织学病理确诊为肺腺癌；具有明确的EGFR基因检测结果；有完善的影像学检查［胸腹部计算机断层扫描（computed tomography,CT）、头颅磁共振成像（magnetic resonance imaging,MRI）］可供肿瘤分期评价；有足够的组织标本可供免疫组化检测；预计生存期超过3个月的患者。排除标准：组织学病理非肺腺癌者（如鳞癌、大细胞癌、小细胞癌等）；缺乏足够的组织标本供免疫组化检测；治疗前分期评价不足的。

1.2 临床资料收集 采集并记录患者确诊时的临床资料，包括年龄、性别、吸烟状态、肿瘤分期、病理亚型、分化程度、EGFR基因突变结果和EGFR-TKIs治疗期间的影像学资料。

1.3 肿瘤分期及病理亚型诊断标准 肿瘤分期依据国际肺癌研究协会颁布的第7版分期标准[19]，肺腺癌病理亚型诊断依据国际肺癌研究协会/美国胸科学会/欧洲呼吸学会2011年颁布的关于肺腺癌的国际多学科新分类标准[20]。

1.4 远期疗效评价标准 远期疗效包括无疾病进展生存期（progression free survival, PFS）和总生存期（overall survival, OS）。PFS定义为从初次治疗开始至疾病进展或任何原因导致死亡的时间，OS定义为从初次治疗开始至死亡或随访终点时间。

1.5 随访 接受EGFR-TKIs治疗的患者通过定期来院或电话随访，随访开始时间为2010年7月，末次随访时间为2017年12月，最短随访时间3个月，最长75个月。

1.6 免疫组化检测Nrf2、Keap1蛋白表达

1.6.1 实验方法 手术切除的组织标本或活检组织标本经10%甲醛固定后，常规石蜡包埋，切片，4 μm厚度。免疫组化采用SP法［兔抗人Nrf2抗体（ab31163）购于Abacm®公司，兔抗人Keap1抗体购于Proteintech®公司，对应的免疫组化二抗SP检测试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司，Nrf2及Keap1抗体均按1:100稀释］，应用PBS代替一抗作为阴性对照，按照试剂说明书进行操作。

1.6.2 结果判定 采用单盲法阅片（病理医师不清楚临床资料），Nrf2抗原阳性反应可位于细胞浆和细胞核中，Keap1抗原阳性反应位于细胞浆内。参照Solis等[21]及曹宝山等[14,17]前期研究结果，将细胞核染色强度和细胞核阳性比例乘积＞0定义为Nrf2阳性，反之为阴性；将评分＞100%，定义为Nrf2高表达，反之为低/不表达。将细胞染色强度和阳性细胞比例乘积＜150%定义为Keap1低/不表达，反之为高表达。

1.7 统计学方法 应用SPSS 19.0 统计学软件分析。率的比较采用卡方检验或Fisher精确检验；相关性检验采用Pearson检验；非参数检验采用Wilcoxon秩和检验，应用Kaplan-Meier方法进行生存分析，Log-rank检验差异性；多因素分析采用Cox多因素分析模型，逐步后退法（backward, walds）。全部统计检验均为双侧概率检验，检验水准α=0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者临床特征 符合入组条件的肺腺癌患者共104例，其中男性57例，女性47例，中位年龄为66岁（21岁-84岁），≥70岁者44例，＜70岁者60例；III期和IV期患者共74例（71.1%）；中低分化者84例（80.8%）。腺泡型、实体型和贴壁型是本研究中最常见的病理亚型，分别为49例（47.1%）、22例（21.2%）及19例（18.3%）。本组患者中EGFR突变率为67.3%（70/104），其中外显子19缺失突变（19del）45例，外显子21 L858R点突变21例，其他突变4例（分别为外显子18 G719A和G724S突变各1例，外显子20 L815P和Y801C突变各1例），见表1。相关分析表明，EGFR突变与肿瘤分期（r=0.176,P=0.073）及吸烟（r=-0.191,P=0.051）有一定相关趋势，但与年龄（r=0.057,P=0.562）、性别（r=0.139,P=0.161）、病理亚型（r=0.080,P=0.418）和病理分化程度（r=-0.097,P=0.328）等无相关。

2.2 Nrf2表达水平及其与患者临床特征间的关系 Nrf2表达在细胞核和细胞浆中均可以表达，且存在个体差异，与曹宝山等前期研究[14]一致。本组Nrf2阳性率为71.2%（74/104），Nrf2阳性水平在性别、分期和EGFR突变状态等组内存在显著差异（P＜0.05）。EGFR突变组中Nrf2阳性率为80.4%，显著高于EGFR野生型组Nrf2阳性率的50%（P=0.001）；女性患者中Nrf2阳性率为80.9%，显著高于男性组的63.2%（P=0.047）；分期越晚Nrf2阳性率越高（P=0.044）。但Nrf2表达水平在年龄、吸烟、肿瘤分化程度、病理亚型等组内无显著差异（P＞0.05），见表2。Nrf2阳性率在19del和21L858R突变患者中分别为80.0%（36/45）和90.5%（19/21），二者无显著差异（P=0.287）。

2.3 Keap1表达水平及其与患者临床特征间的关系 Keap1主要表达在细胞浆中，与曹宝山等前期研究结果[17]一致。本组Keap1高表达率为34.6%（36/104）。Keap1表达水平与肿瘤分期有一定相关趋势，但在年龄、性别、吸烟、病理亚型、分化程度、EGFR突变状态等组内无显著差异（P＞0.05），见表3。

2.4 Nrf2表达水平及其与EGFR-TKIs治疗患者临床特征间的关系 本研究中38例患者接受了EGFR-TKIs治疗，无EGFR基因突变者2例，资料不全者6例，30例EGFR突变接受EGFR-TKIs治疗且资料齐全。30例患者中，17例为吉非替尼，6例为厄洛替尼，7例为埃克替尼；Nrf2阳性率为86.7%（26/30），Nrf2高表达率为40.0%（12/30）。Nrf2的高表达率与性别有关，女性组为63.2%（12/19），显著高于男性组的0（0/11）（P=0.001），但在年龄、吸烟、肿瘤分化、肿瘤分期和EGFR突变类型等组内无显著差异（P＞0.05），见表4。

2.5 生存分析 30例EGFR-TKIs治疗的患者中，相关分析表明PFS与Nrf2高表达呈负相关（r=-0.527,P=0.003），而与年龄、性别、吸烟、肿瘤分化、肿瘤分期、Keap1表达水平等无关（P＞0.05）。Nrf2高表达组患者的PFS显著低于不/低表达组，分别为（4.6±2.9）个月和（20.2±16.1）个月（P=0.003）。Kaplan-Meier生存分析表明：①Nrf2阳性组和阴性组间的OS无显著差异，中位OS分别为24.0个月（95%CI: 15.3-32.7）和50.0个月（95%CI: 0.0-106.9）（P=0.861），图1A。②Keap1高表达组和不/低表达组间的OS无显著差异，中位OS分别为23.0个月（95%CI:16.6-29.4）和50.0个月（95%CI: 0.0-101.5）（P=0.801），图1B。③Nrf2高表达组的OS显著低于不/低表达/组，中位OS分别为15.0个月（95%CI: 10.0-20.0）和60.0个月（95%CI: 44.8-75.2）（P=0.001），图1C。④患者OS与EGFR突变类型无关。19del、21L858R和罕见突变组的中位OS分别50.0个月（95%CI: 3.5-96.5）、20.0个月（95%CI:6.0-34.0）和3.0个月（P=0.695），图1D。⑤患者的OS与分期无关，IIIb期和IV期两组的中位OS分别为60.0个月（95%CI: 4.3-115.7）和24.0个月（95%CI: 13.0-35.0）（P=0.604），图1E。

2.6Cox回归分析 在校对患者EGFR基因突变状态、Keap1表达水平、分期、性别和Nrf2高表达等因素后，多因素分析表明Nrf2高表达是EGFR-TKIs PFS（P=0.002）和OS（P=0.009）的独立预测因素。Keap1表达水平对PFS和OS无显著预测价值（P＞0.05），见表5。

表 1 104例肺腺癌患者临床病理特征Tab 1 Clinicopathologic characteristics of 104 lung adenocarcinoma cases

3 讨论

肺腺癌目前是NSCLC中最常见的病理类型，已发现EGFR、ALK、ROS1等多种驱动基因[22]，其中EGFR在亚裔患者中是最常见的一种[6,7,22]。本研究中EGFR突变率67.3%（70/104)，19del和21L858R突变占整体突变的94.3%，EGFR突变倾向于发生在分期晚和不吸烟的患者中，与既往研究结果类似[4,6,7]；但本研究中EGFR突变的发生与性别和病理亚型无关，且19del突变显著多于21L858R突变，与前期研究结果不同[23]。产生差异的原因在于病例非连续入组，存在选择偏倚。EGFR-TKIs是进展期EGFR基因敏感突变患者一线治疗的首选药物，但耐药仍是临床面临的难题。Nrf2/Keap1通路是细胞应对氧化应激和亲电性应激损伤的重要防御通路，Nrf2、Keap1在肺癌中与药物耐药和肿瘤发生、发展和转移密切相关。曹宝山等前期研究表明Nrf2/Keap1通路与肺癌化疗和靶向治疗疗效有关，其中Keap1高表达会降低铂类药物疗效[17]，而Nrf2高表达会减低EGFR-TKIs的疗效[14]。近期Krall等发现Keap1功能缺失会导致EGFR-TKIs耐药[16]。但Nrf2和Keap1的表达水平与EGFR基因突变状态是否相关，且Keap1的表达水平是否会影响EGFR-TKIs的疗效，目前缺乏此方面的临床研究。

本研究通过免疫组化方法检测104例肺腺癌患者，结果发现Nrf2阳性率为71.2%，其中在EGFR基因突变组Nrf2阳性率为80.4%，显著高于EGFR基因野生型组的50.0%（P=0.001），但Nrf2阳性率在19del和21L858R两突变组间无显著差别（P＞0.05）。在EGFR基因突变组中Nrf2阳性率与前期小样本研究结果类似（77.4%）[14]，但远高于Solis等[21]报道的26.0%的阳性率。本研究还发现Nrf2阳性率与分期有关，分期越晚Nrf2阳性率越高（P=0.044），与朱翔等研究结果[14]类似。本研究结果与Solis等[21]产生差异的原因为：①Solis等[21]研究的患者以早期为主，晚期患者数量不足1/4；②Yamadori等[15]研究发现EGFR信号活化可上调Nrf2表达水平，因此在EGFR敏感基因突变患者中，EGFR通路活化是导致Nrf2阳性表达率增高原因之一；③Solis等[21]报道的23例EGFR基因突变患者中无Nrf2阳性表达，此种差异或许与肿瘤分期、种族等因素有关。本研究中Keap1高表达率为34.6%（36/104），高于前期研究中的26.0%（13/50）[17]，Keap1的表达水平与肿瘤分期有一定相关趋势，但与EGFR突变状态无关。与前期研究产生差异的原因或许在于前期研究中含有40%鳞癌患者及样本量较小[17]。上述结果可通过前瞻性研究得到进一步的验证。

表 2 Nrf2阳性率同肺腺癌患者临床特征间的关系Tab 2 Relationship between positive Nrf2 and clinicopathologic characteristics of lung adenocarcinoma patients

本研究在含有EGFR基因突变并且接受EGFR-TKIs治疗的患者中发现：EGFR-TKIs的疗效与Nrf2表达水平显著相关，Nrf2高表达组的PFS和OS显著低于Nrf2不/低表达组，多因素分析表明Nrf2表达水平是EGFR-TKIs治疗患者PFS和OS的独立预后因素。这与朱翔等研究结果相一致[14]，且与Yamadori等[15]在含有EGFR基因敏感突变的细胞株中发现的现象一致，即Nrf2激活会导致EGFR-TKIs耐药。这或许是因为：Nrf2一旦激活，其进入细胞核中，进而激活ARE调控的药物解毒酶和代谢酶，从而促进细胞增殖、抑制细胞凋亡[9,24]。但在本研究中，患者的PFS和OS与EGFR基因不同突变位点无关，这与Jackman等[25]研究结果不同，即外显子19del突变人群的OS优于21858R突变的人群。可能与本研究样本量小有关。

表 3 Keap1阳性率同肺腺癌患者临床特征间的关系Tab 3 Relationship between Keap1 expression and clinicopathologic characteristics of lung adenocarcinoma patients

图 1 EGFR-TKIs治疗患者总生存期在不同组间的变化。A：Nrf2阳性组和阴性组患者的中位OS无显著差异；B：Keap1高表达组和不/低表达组患者的中位OS无显著差异；C：Nrf2高表达组中位OS显著低于不/低表达组；D：EGFR基因不同突变组的中位OS无显著差异；E：IIIb期和IV期患者的中位OS无显著差异。Fig 1 Overall survival (OS) of patients treated by EGFR-TKIs in different groups.A: The median OS of lung adenocarcinoma patients between Nrf2 positive group and Nrf2 negative group were similar； B: The median OS of lung adenocarcinoma patients between Keap1 high expression group and Keap1 low/negative expression group were similar； C: The median OS of lung adenocarcinoma patients of Nrf2 high expression group was significantly lower than that of Nrf2 low/negative group； D: The median OS of lung adenocarcinoma patients among different EGFR mutation groups were not significantly different； E: The median OS of lung adenocarcinoma patients between stage IIIb and stage IV were similar.

表 4 Nrf2高表达率同接受EGFR-TKIs治疗肺腺癌患者临床特征间的关系Tab 4 Relationship between Nrf2 nuclear high expression and clinicopathologic characteristics of lung adenocarcinoma patients treated by EGFR-TKIs

表 5 多因素分析EGFR-TKIs特异性生存的预后因素(n=30)Tab 5 Cox regression analysis of the disease-specific survival with EGFR TKIs (n=30)

本研究Keap1高表达组与不/低表达组的两组患者在PFS和OS均无显著差异，提示Keap1表达水平或许与EGFR-TKIs疗效无关。但Krall等[16]发现Keap1功能消失会激活Nrf2，进而导致厄洛替尼的耐药[16]。两项研究结果之间产生差异的原因在于：①Keap1是细胞内环境敏感的传感器，Keap1表达情况随着外界环境刺激发生改变[9]，其真正发挥作用具有一定滞后性；②Krall等[16]研究利用的基因敲除技术，使得Keap1功能真正消失，而本研究中Keap1的表达水平并不能代表Keap1基因的功能。因此，Keap1对EGFR-TKIs疗效的影响进一步需要在基因水平进行验证。

本研究通过回顾性研究分析，发现Nrf2阳性率在EGFR基因突变的患者显著升高，Nrf2高表达者EGFRTKIs的PFS和OS差，多因素分析表明Nrf2表达水平是EGFR-TKIs PFS和OS的独立预测因子，但Keap1表达水平与EGFR基因突变状态及EGFR-TKIs疗效无关。综上可见，Nrf2在含有EGFR突变患者中或许是预测EGFR-TKIs疗效理想的分子指标，还是提高EGFR-TKIs疗效潜在的干预靶点。需要进一步扩大样本量进行前瞻性研究，验证Nrf2和Keap1的临床价值，并通过基因检测明确其具体机制。