高效液相色谱法分析银杏达莫的游离总氨基酸含量及其与维生素C的配伍观察

李燕灵，林夏飞

0 引言

银杏达莫注射液是由银杏提取物和双嘧达莫制成，临床上用于治疗冠心病、高血压等疾病[1]，银杏叶提取物的活性成分主要为银杏黄酮和银杏萜内酯[2]。双嘧达莫是一种传统的心血管系统药物，其具有抗凝及扩张冠状动脉的效果[3]。银杏达莫注射液对于预防心肌缺血-再灌注损伤具有显著的改善效果[4]。有些研究对银杏达莫注射液的成分进行研究，但是主要为双嘧达莫和槲皮素等[5]，尚未有研究人员对银杏达莫中的氨基酸含量进行分析，并且对于银杏达莫与其他药物配伍方面，也未见有银杏达莫与维生素C配伍稳定性的相关报道。为了对银杏达莫产品质量进行进一步控制，本研究对银杏达莫中氨基酸含量进行分析，并观察银杏达莫与维生素C配伍的稳定性，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 所需试剂 银杏达莫注射液(A企业，批号：20161202；B企业，批号：161033；C企业，批号：160915)；甲醇、乙酸(美国Tedia公司)；17 种氨基酸混合溶液标准物质 GBW(E) 100062(购自中国计量科学研究院)；维生素C标准品(购自中国药品生物制品检定所，规格：100 mg/瓶，批号：162139C)，维生素C注射液[购自北京双鹤药业，批号：A201701182，规格：含维生素C(C6H8O6)2 g]；甲醇、乙酸为色谱纯，其他试剂均为分析纯试剂。

1.1.2 主要仪器 Agilent 1200 型高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；Veriti BP113D型分析电子天平(德国赛多利斯股份公司)；1300 A2型超声清洗器(北京六一仪器厂)；D116C型高压灭菌器(日本SANYO公司)；Mlilli-QM超纯水纯化仪(德国默克密理博公司)。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱为Venusil ASB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，色谱柱及样品的温度为25 ℃，流速为0.5 ml/min，上样量为3 μl；流动相：A相为0.15%(v/v)的乙酸水溶液，B相为含0.9%(v/v)的乙酸和30%(v/v)的甲醇水溶液。梯度程序：0～2.5 min，100%A；2.5～5 min，0～17% B；5～8 min，17%～33% B；8～8.5 min，33%～100% B；8.5～17 min，100%B。

1.2.2 检测样品溶液制备 使用0.22 μm滤膜将配伍比例为5∶1的银杏达莫注射液、维生素C注射液过滤，取200 μL样品溶液待测。

1.2.3 标准品溶液制备 取17种氨基酸混合溶液标准物质 200 μl，加水800 μl。得到混合标准储液。依次取混合标准储液 25、50、100、200、400 μl，分别加水至1 000 μl，得5个系列浓度的混合标准品溶液。

精密称取维生素C标准品0.1 g，加流动相定容至100 ml，使标准品溶液浓度为1 mg/ml，用移液器吸取1 ml加入至容量管中，加入流动相至终浓度为20 μg/ml，作为最终标准品。

1.2.4 重复性及再现性 采用同样方法，在第1次测定后1 d内测定200 μl样品溶液，计算日内重复性的变异系数。采用同样方法在第1次测定后3 d测定200 μl样品溶液，计算日间重复性的变异系数。

1.2.5 绘制标准曲线 采用外标法考察氨基酸的标准曲线，以氨基酸峰面积作为纵坐标，以氨基酸浓度为横坐标绘制标准曲线，得到17种氨基酸的回归方程。

1.2.6 检出限 使用相应的软件对结果进行计算，检出限(LOD)=各目标物色谱峰的信噪比(S/N)。

1.2.7 配伍变化情况 在室温(20±1) ℃及不避光的条件下，分别在0、1、2、4、8、12、24 h观察配伍溶液的外观变化情况，测定配伍溶液的pH值，并检测配伍溶液不溶性微粒数。

2 结果

2.1 标准工作曲线情况 以氨基酸峰面积为纵坐标，氨基酸浓度为横坐标绘制标准曲线，得到17种氨基酸的回归方程。其中相关系数最高为Leu的0.999 7，最低为Met的0.995 7，检出限最高为His的4.04 μmol/L，最低为Asp的1.16 μmol/L，见表1。

2.2 加标回收率情况 对3种银杏达莫注射液检测后各氨基酸的加标回收率进行统计，结果显示，3种银杏达莫注射液加标回收率最高的氨基酸均为Pro (107.0%、104.0%、105.2%)，最低分别为Gly (75.4%)、Glu (76.1%)、Phe (75.8%)，精密度最高为Ile (5.06%)，最低为Gly (1.43%)。见表2。

2.3 游离氨基酸含量 对3种银杏达莫注射液中17种游离氨基酸的含量进行统计，结果显示，3种银杏达莫注射液中17种游离氨基酸的含量最高均为Leu (6.12、6.39、6.33 mg/g)，所有3种银杏达莫注射液中17种游离氨基酸的平均总含量为61.26。见表3。

表1 银杏达莫中17种游离氨基酸的线性回归方程、相关系数及检出限

表2 银杏达莫中17种游离氨基酸的加标回收率及精密度(%)

2.4 银杏达莫与维生素C配伍溶液外观及pH值变化情况 对3种银杏达莫注射液与维生素C配伍溶液不同时间的外观及pH值变化情况进行统计，结果显示，所有3种银杏达莫注射液与维生素C配伍后的溶液24 h内外观检测和观察均未出现沉淀、浑浊情况，并且无气体产生，也无颜色变化，pH值呈现缓慢上升的趋势。见表4。

2.5 银杏达莫与维生素C配伍溶液不溶性微粒数 对3种银杏达莫与维生素C配伍的溶液中不溶性微粒数进行统计，结果显示，3种银杏达莫与维生素C配伍的溶液中≥10 μm的不溶性微粒数随时间增加而缓慢增加，而≥25 μm的不溶性微粒数随时间增加基本无变化。见表5。

表3 银杏达莫中17种游离氨基酸的含量

表4 配伍溶液不同时间外观及pH值情况

表5 配伍溶液不同时间不溶性微粒数(粒/ml)

3 讨论

王倬晅等[6]研究显示，高效液相色谱可以有效、简便、精确地测定银杏达莫注射液水解前芦丁、槲皮素的含量。任洁等[7]认为，高效液相色谱可用于银杏达莫氯化钠注射液的质量控制。王芮等[8]采用高效液相色谱对银杏达莫注射液中双嘧达莫含量进行测定，认为高效液相色谱可以用于银杏达莫注射液的质量控制。李荣等[9]观察银杏达莫与三磷酸胞苷二钠注射液配伍的稳定性，认为两种药物在配伍后6 h内外观、pH值及峰形均无明显变化，含量在4 h后明显下降。两种药物在0.9%氯化钠注射液或5%葡萄糖注射液中可配伍使用，但应在4 h内使用完。宁小艳等[10]认为，银杏达莫注射液可以与0.9%氯化钠注射液、5%葡萄糖注射液、10%葡萄糖注射液配伍使用。陈玲玲等[11]认为，银杏达莫注射液与阿昔洛韦注射液存在配伍禁忌。范翠琼等[12]认为，银杏达莫与奥硝唑注射液混合后不稳定性风险增加，不建议混合使用。何正有等[13]认为，银杏达莫注射液与吡拉西坦、维生素B6、硝酸甘油和多索茶碱可以配伍使用，而银杏达莫注射液不宜与三磷酸胞苷二钠、尼莫地平和奥扎格雷钠配伍使用。张念森等[14]研究显示，在室温下，24 h维生素C和维生素K1的配伍液出现浑浊；而与肌苷注射液的配伍外观无变化，但pH值及含量有变化，即溶液的稳定性发生变化。叶刚等[15]认为，丹参注射液与维生素C注射液配伍后的pH值和不溶性颗粒无明显变化，溶液颜色有变化，有效成分含量变化较大。

本研究中未能检测到银杏达莫注射液与维生素C注射液配伍后的溶液中的小肽类成分，并且对检测样品中的同分异构体仍无法分辨，因此，应优化检测方法，开发新的检测方法，提高对衍生产物的检测速度及选择性，开发新的检测试剂配伍，提高各种检测试剂及衍生产物的稳定性，提高同分异构体和衍生物的检出率和正确率。

通过本研究，我们可以明确分析银杏达莫注射液中17种游离氨基酸的含量，并且通过高效液相色谱技术，分析银杏达莫可以与维生素C配伍使用，所以我们认为，高效液相色谱技术可以用于银杏达莫注射液的质量控制以及分析其与维生素C的配伍使用情况。