四子种王胶囊对少弱精子症患者治疗前后的精子质量、氧化应激损伤及ACP、HYD、ACE表达的影响

王 琰，王旭初，卢 娜，王慧君

0 引言

少弱精子症是引起男性不孕的主要原因之一[1]。隐睾、精索静脉曲张、生殖道感染、内分泌疾病、免疫异常、遗传疾病等是该病症主要的诱因[2]，但仍然有70%以上的男性不育病因不明[3]，即使已知病因的不育中，其发病机制也尚未完全阐明[4]。现阶段以营养疗法、激素治疗、外科手术和抗感染辅助生殖技术等作为主要的治疗方案，但均未达到理想的效果[5]。中医对少弱精子症的治疗，生精功能的改善方面以辨证论治为原则，具有一定的疗效[6]。虽然有报道，精液中精子的数量和活动精子的百分率与自然妊娠率有统计学意义的相关性[7]，但临床仍有1/3的男性不育患者的精液常规分析结果正常或接近正常[8]。因此，依靠精液常规分析判断男性生育能力具有局限性，对于具有此症状超过1年的患者应进行精子功能检查，如：精子-透明质酸结合实验，精子顶体酶活性定量，钙离子诱发顶体反应，精子的氧化应激损伤，以及精子顶体内其他酶的活性(ACP、HYD、ACE)等指标，这些指标均与不育有关[9-11]。四子种王胶囊有补肾益气、通脉化瘀、通腹将浊的功效。中医将肾虚作为引起男性不育的一个重要原因，其中主要病因为肾精亏虚，肾阳不振。因此，对男性不育症的主要治疗方法为补肾益精。四子种王胶囊方中韭菜子、淫阳藿、肉苁蓉、鹿角胶、覆盆子等均为补阳之品，其作用为固肾生精，益肾壮阳，另外还有补肝、滋阴养血、去风除湿等功效，有提高精子数量及质量、改善精子功能等功效，但作用机制尚不清楚。本文旨在研究四子种王胶囊在治疗少弱精子症患者中的作用机制及疗效。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选择我院2016年5月至2017年5月入院确诊的126例不育症患者，年龄22～31岁，患者已婚，均为正常性生活，除外女方不育原因者。入选标准[12]：婚后1年时间以上未采用避孕，正常性生活，女方正常生育力，采用3次以上标准精液分析，精子均显示浓度低，a级精子活动率小于25%，a+b级精子活动率小于50%。患者具有较好的依从性，均知情同意(批号：2017073)。排除标准[13]：勃起功能障碍，射精障碍，无精子症；泌尿生殖系统先天畸形，于近期服用影响精子活力和生精功能的药物(抗癫痫、抗肿瘤药物)；精子或染色体出现基因异常；存在精神疾病，或具有肝、肾、造血系统严重疾病，心血管疾病。排除生殖系统严重炎症以及精索曲张等其他可能导致男性不育的疾病。

1.2 用药方案 对照组常规西医方案：进餐时口服左卡尼汀口服溶液(东北制药，国药准字H19990372) 10 ml/次，早晚各1次；葡萄糖酸锌片(海南制药厂有限公司，国药准字H46020030)，1片/次，3次/d，治疗3个月。观察组治疗方案：在常规西药治疗的基础上，加四子种王胶囊(冀药制字z20070043)，5粒/次，2次/d，连服3个月。四子种王胶囊药物组成：淫羊霍18 g，韭子12 g，石斛9 g，菟丝子10 g，肉苁蓉8 g，覆盆子8 g，桑寄生9 g，怀牛膝10 g，蚕蛾9 g，鹿角胶20 g，熟地12 g，枸杞子8 g，当归15 g。

1.3 精子标本来源 患者禁欲3～5 d，用新洁尔灭消毒手及尿道口，手淫法将全部精液置于无菌塑料容器内，至37 ℃恒温水浴箱中，孵育30 min，完全液化后，取20 μl稀释于380 μl精子稀释液中，高倍镜下计数四角及中央5个方格内精子数，参考值：精子计数>20×109/L。显微镜下观察精子密度、精子活动率和精子畸形率。依据WHO判断精子活动度的标准[14]，精子活力分4级：a级精子活动良好，呈快速、活泼、直线向前运动；b级精子能活动，但方向不明确，呈快速或迟钝直线或非直线向前运动；c级精子活动不良，原地打转或旋转，向前运动能力差；d级精子不活动。精子活动度分级标准：<20%，20%～40%，>40%。少精症为精子密度<20×106/ml，>5×106/ml；弱精症：活率<75%，a+b级精子活力<50%或a级精子活力<25%；少弱精子症患者均低于以上标准。

1.4 精液ACP、HYD、ACE检测 ACP活性检测方法[15]：取1 ml精液，用Earle液洗涤2遍，500 r/min离心10 min，配成1×106精子/ml悬液置于37 ℃ 1 h使之获能，加入1 mmol孕酮至终浓度10 μmol/L诱导顶体反应，1 h后，1 000 r/min离心1 min，取上清10 μl，利用磷酸苯二钠法检测ACP活性。

ACE、HYD检测方法[16]：精液经1 000 r/min离心10 min，留下层沉淀物，经PBS清洗2次，最终将沉淀精子悬浮于PBS缓冲液中。利用改良的明胶底物膜片和改良透明质酸-明胶底物膜片，置于37 ℃恒温孵箱，3 h后取出，干燥后，显微镜下观察结果。均匀选取5～6个视野，观察100个精子，通过判断精子头部是否出现晕环判断ACE和HYD是否阳性。利用显微镜上的微尺检测晕环直径大小，以直径大小判断ACE和HYD活性强度。

1.5 ROS、MDA、SOD检测方法 利用精子细胞氧化应激活性氧(ROS)鲁米诺化学发光法定量检测试剂盒检测精子细胞中ROS水平，具体操作见产品说明书(GENMED精子细胞氧化应激活性氧鲁米诺化学发光法定量检测试剂盒，上海杰美基因医药科技有限公司)。利用精子细胞MDA和超氧化物歧化酶(SOD)含量比色法定量检测试剂盒检测MDA和SOD含量，其中MDA采用硫代巴比妥酸法检测，SOD活性采用黄嘌呤氧化酶法检测(南京建成生物研究所)。具体操作参照产品说明书。

2 结果

2.1 两组精子密度比较 治疗后，观察组、对照组患者的精子密度均得到改善(P<0.05)，且观察组高于对照组(P<0.05)；通过精子活率评估精子质量发现，两组治疗前差异无统计学意义(P>0.05)，治疗后，观察组精子活率明显高于对照组(P<0.01)。见表1。

2.2 两组精子活动度及精子畸形率比较 治疗前，两组精子活动度和畸形率比较差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后镜检观察显示，观察组患者精子活动度增加，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.3 两组患者ACP活性检测结果 治疗后，两组患者ACP活性均达到了正常范围，观察组ACP活性高于对照组(P<0.05)。见表3。

2.4 两组HYD、ACE阳性率及活动强度比较 治疗前两组HYD、ACE及活动度比较差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后，观察组HYD、ACE阳性率及HYD、ACE活性强度高于对照组(P<0.05)。见表3。

2.5 两组氧化应激损伤指标比较 治疗前，两组氧化应激损伤相关指标(ROS、MDA、SOD等)比较差异无统计学意义；治疗后，观察组ROS、MDA水平明显低于对照组(P<0.05)，SOD水平高于对照组(P<0.05)。见表4。

2.6 不良反应 治疗期间，两组患者均未出现明显的不良反应。

表1 不同方案治疗后精子密度比较

表2 治疗后两组精子活动度及精子畸形率比较

表3 两组患者HYD、ACE阳性率及活性强度比较(n=63)

表4 两组患者氧化应激指标比较(n=63)

3 讨论

精子形态、密度、活率是受精过程中的重要参数[17]。精子形态有头端染色致密浓缩的细胞核，细胞核周围有一层很薄的细胞质。前端富含多种溶酶体酶，主要有顶体酶ACE、透明质酸酶HYD和酸性磷酸酶ACP。精浆ACP与精子密度、活动率及活力相关，精浆ACP活性可作为男性不育精子质量检测的指标之一。而顶体酶ACE活性的不足可导致不育、临床精子存活率低、死精症以及严重的生殖系统感染，特别是解脲支原体感染可导致精子顶体酶活性低，目前，顶体酶活性定量是判断男性精子功能和生育力强弱的重要评价指标之一[18]。本研究发现，联合治疗组患者的各项生殖指标均优于单纯常规西医治疗组，提示四子种王胶囊在治疗男性不育方面有较好的疗效。其不仅提高了精子的浓度，还改善了精子的运动能力，推测四子种王胶囊可能通过改善睾丸供血或生殖内分泌，促进精子生成。

本研究显示，观察组精子内氧化应激损伤的改善程度优于对照组。ROS是信号传导中的重要媒介，能调节精子的获能和顶体反应等正常生理过程[19]。SOD则为精浆中清除ROS的活性酶[20]，ROS的产生和清除存在一定的平衡，若平衡被打破，则产生一定的氧化应激损伤。维生素E能够维持谷胱甘肽过氧化物酶活性，有利于MDA清除，改善SOD活性。四子种王胶囊的成分复杂，但整体明显改善了氧化应激损伤，清除了过多的自由基，改善了体内的抗氧化能力，进而改善附属性腺的分泌功能，提高精子的运动能力。有报道，ROS对精子的损伤是导致男性不育的重要病因[21-22]。正常情况下，一定程度受控的ROS在精子获能、精子高活跃性运动以及顶体反应中起重要作用，当ROS产生超出了抗氧化系统的清除能力，则产生多种毒性作用，损伤生精功能[23]。因此，ROS以及与之平衡相关的SOD的平衡对维持正常的生理功能发挥重要作用。 综上所述，补肾益精治疗可以很好地改善少弱精子患者的生精功能，其能改善ROS、SOD等指标，改善的氧化还原环境可能有利于精子的发生和成熟。总之，四子种王胶囊在治疗少弱精子症患者的机制复杂多样，其可能通过多种机制、多靶点改善精液质量，进而治疗男性不育症。