远志抗老年痴呆活性部位筛选

孟磊，庞月

(1.盘锦职业技术学院，辽宁 盘锦 124000；2.葫芦岛市食品药品检验检测中心，辽宁 葫芦岛 125000)

阿尔茨海默症(alzheimer’s disease，AD)是一种以记忆功能减退为主要标志的神经系统性疾病，其发病机制较为复杂，主要包括β-淀粉样蛋白(amyloid β-protein，Aβ)的沉积、tau 蛋白的过度磷酸化、氧化应激、神经炎症、神经元丢失等[1-2]。据2016年报道显示，全球AD患者已超过5 000万，预计到2050年，全世界AD患者将超过1亿3 000万。目前临床上用于治疗AD的药物是乙酰胆碱抑制剂和N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂，但疗效不尽如人意，且存在着一定的副作用[3]。对于多因素引起的疾病，例如AD，针对单一靶点的治疗很难达到治疗预期。研究者已把寻找单一靶点药物的治疗思路转变为多靶点、多通路治疗的思路。中药作为天然药物，其多成分具有多靶点的治疗机制，且天然药物逐渐被FDA所接受[4]。因此，从中药中寻找治疗AD的药物，并阐明其物质基础及分子作用机制越来越受到研究者的广泛重视和关注。

据《中国药典》2015年版一部记载，远志(Polygalae Radix)为远志科植物远志PolygalatenuifoliaWilld或卵叶远志PolygalatenuifoliaWilld的干燥根，始载于《神农本草经》，是常用于治疗情志类疾病的中药，其性温，味苦、辛，归心、肾、脾经，具安神益智、交通心肾、祛痰、消肿等功效[5]。现代药理作用研究发现，远志具有抗氧化、保护神经元、改善学习记忆及保护心脑血管等疾病的功效；而研究表明，氧化应激、神经元丢失、学习记忆功能丢失都是阿尔茨海默症的病因[6]。因此，本研究运用行为学和生化指标集中于研究远志的抗AD的药效物质及其可能的作用相关机制，为其今后的开发利用提供一定的实验依据。

1 仪器与材料

UV759S型紫外-可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)，JA5003十万分之一分析天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)。BSA124S电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)，ZDHW调温电热套(北京中兴伟业仪器有限公司)，KQ-200KDB型高功率数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，HH-4型数显电热恒温水浴锅(国华电器有限公司)，FW100高速万能粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司)，标准检验筛(浙江上虞银河测仪器厂)，倒置显微镜(Nikon，日本)，流式细胞仪(BD，美国)，Morris水迷宫，Y迷宫(北京智多宝科技有限公司)。

远志购自于北京同仁堂，经成都中医药大学中药鉴定教研室为远志科植物远志PolygalatenuifoliaWilld的干燥根，芦丁、去羟基远志皂苷元(购自于大连美仑生物科技有限公司)，纯度≥98%，D101大孔吸附树脂(沧州宝恩吸附材料科技有限公司)，无水乙醇、双氧水、95%乙醇(山东禹王集团)，NaNO2、Al(NO3)3、NaOH(天津富宇精密化工有限公司)，所有试剂均为分析纯。

昆明种SPF级雄性小鼠84只，体重18～22 g，由四川省医学科学院实验动物研究所提供。许可证号：SCXK(川2015-29)。

2 方 法

2.1 远志总黄酮的含量测定

分析天平称取干燥至恒重的芦丁对照品10.0 mL于50 mL棕色容量瓶中，用无水乙醇溶解并定容至刻度线，得到0.2 mg/mL芦丁标准溶液。移液管精密移取0、1、2、3、4、5、6 mL于25 mL容量瓶中，分别补加蒸馏水使体积均为6 mL，加入5%NaNO2溶液1 mL，混匀，放置6 min，加入10%Al(NO3)31 mL，混匀，放置6 min，加入4%NaOH溶液10 mL后再加蒸馏水至刻度线，定容，放置15 min后在510 nm紫外分光光计下测定其吸光值，以芦丁的含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线[7]。得标准曲线为A=6.411 6 C + 0.040 5，R2= 0.999 1。

2.2 远志总皂苷的含量测定

称取去羟基远志皂苷元11.56 mg于20 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度线，定容，即得0.578 mg/L去羟基远志皂苷元标准溶液。移取0、20、40、60、80、100 μL于6支具塞磨口中，水浴加热挥去甲醇后加入1.0 mL 5%香兰素试剂、4.0 mL高氯酸，密塞，摇匀，于60 ℃恒温水浴中加热15 min后取出冷却至室温，于560 nm处测定吸收度，以去羟基远志皂苷元浓度为横坐标，吸收度A为纵坐标，绘制标准曲线。得标准曲线为A=0.017 5 C - 0.008 2，R2= 0.999 6。

2.3 远志总皂苷粗提物的制备

2.5 kg远志加6倍量的85%乙醇提取液回流提取3次，每次2 h，滤过，合并滤液，减压蒸干，得远志总提物浸膏530 g，备用。加1倍量水溶解，用水饱和的醋酸乙酯提取3次，弃去醋酸乙酯层，合并水层，减压蒸干，得远志总皂苷粗提物310 g，备用。

2.4 大孔树脂预处理

称取10倍量的D101大孔吸附树脂于烧杯中，加入95%乙醇浸泡24 h，使其充分溶胀活化，装柱，加入95%洗脱至流出液无浑浊，再用纯净水洗脱至无醇味，备用。

2.5 远志总皂苷的富集

将得到的远志总皂苷粗提物用热水分散，装柱，依次用蒸馏水、10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇进行洗脱，每个梯度4 BV，合并相同梯度洗脱液，减压蒸干，得各个馏分65、56、79、36、32、16 g，备用。

2.6 动物实验

将84只KM小鼠随机分为7组，每组12只，分别是对照组、模型组、给药组(10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇洗脱馏分)150 mg/kg，给予模型组、给药组小鼠按2 mg/kg皮下注射东莨菪碱，连续7 d，建立小鼠记忆障碍模型。并在每天早晨8:30灌胃给药，连续给予10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇洗脱馏分21 d，对照组、模型组给予等体积的生理盐水，最后一次给药后，进行Morris水迷宫、Y迷宫实验，行为学实验测试后，将小鼠脱颈处死，取其海马和皮质，称其重量-80 ℃保存备用。

2.7 Morris水迷宫实验

将水迷宫分为均等的4个象限，分别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限，小鼠入水点为4个象限贴壁的正中部位，并将平台放置于Ⅰ象限水平面以下1 cm，水温为(20±2) ℃。此次实验由两部分实验组成，分别是定位巡航实验和空间探索实验，实验步骤：(1)定位巡航实验，这是一个学习记忆的过程，为5 d，将小鼠分别从4个象限面壁放入水中，由视频系统记录其找到平台的所需时间，即为逃避潜伏期。小鼠找到平台并在平台上停留10 s，则其学习停止；若小鼠在120 s内未找到平台，则将其放至平台上10 s，实验结束后记录其逃避潜伏期为120 s；(2)空间探索实验：在水迷宫第6 天，将平台撤去，让大鼠在无平台的情况在迷宫游泳120 s，记录其跨越原平台次数。

2.8 Y迷宫测试

在本实验中的Y迷宫实验，由3个(A、B、C)等长、互成120。的臂组成的，每臂长宽高45 cm × 14 cm × 15 cm，臂中间有透明有机玻璃盖，将小鼠放入一臂的末端(A臂)，作为起始臂，记录8 min内小鼠进臂总数和连续3次进入不同臂的次数，即ABC、ACB、BCA、BAC、CAB、CBA。计算其自发交替率，计算公式为：自发交替率 = 连续3次进入不同臂的次数/(进臂总数-2)× 100%。

2.9 ROS、MDA、SOD、CAT、GSH-Px的含量测定

将海马和皮质按重量加入5倍量的生理盐水，超声破碎后离心，吸取上清液150 μL按ROS、 MDA、SOD、CAT、GSH-Px试剂盒说明书操作，于530、530、550、240、412 nm波长下测定OD值并计算其含量。

2.10 采用SPSS19.0软件对数据进行统计学分析，计量资料用±S表示，采用两样本均数比较的t检验。

3 结 果

3.1 不同洗脱馏分黄酮含量测定

按“2.1”条件下，对各个富集的洗脱馏分进行黄酮含量测定，测定结果显示30%洗脱馏分的黄酮含量最高，50%次之，结果见表1。

表1 不同洗脱馏分黄酮含量的测定结果

3.2 不同洗脱馏分远志总皂苷含量测定

按“2.2”条件下，对各个富集的洗脱馏分进行远志总皂苷含量测定，测定结果显示70%洗脱馏分的远志总皂苷含量最高，结果见表2。

表2 不同洗脱馏分远志总皂苷含量的测定结果

3.3 Morris水迷宫测试结果

如图1A所示，50%和70%洗脱馏分给药小鼠在学习的第4天时，与模型组相比，逃避潜伏期明显缩短(P<0.05，P<0.05)，而在学习的第5 天，50%和70%洗脱馏分给药小鼠的逃避潜伏期也会明显缩短(P<0.05，P<0.01)，而其它给药小鼠的逃避潜伏期差异无统计学意义(P>0.05)。如图1B在探索实验中，与模型组相比，50%和70%洗脱馏分给药小鼠穿过平台的次数明显增多(P<0.05，P<0.01)。

3.4 Y迷宫测试结果

如图2A所示，所有小鼠在测试8 min内进入臂的总数均无显著性差异，这表明东莨菪碱和不同洗脱馏分给药组对小鼠的自主活动均没有影响。图2B显示与对照组相比，模型组的自发交替率明显降低(P<0.01)，而50%，70%洗脱馏分会明显增加小鼠的自发交替率(P<0.05，P<0.01)，其它给药组对模型小鼠的自发交替率无影响。

**P<0.01，***P<0.001 vs 对照组;#P<0.05，##P<0.01 vs 模型组

图1 不同洗脱馏分对东莨菪碱诱导的记忆障碍模型小鼠在Morris水迷宫实验中的实验结果(n=12)

**P<0.01vs 对照组;#P<0.05，##P<0.01vs模型组

图2 不同洗脱馏分对东莨菪碱诱导的记忆障碍模型小鼠在Y迷宫实验中的实验结果(n=12)

3.5 不同馏分对东莨菪碱诱导记忆障碍小鼠模型中ROS、MDA、SOD、CAT、GSH-Px的影响

如表5所示，与正常组相比，模型组中的海马和皮质中的ROS、MDA会显著性升高(P<0.01)，而抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px的活性则会降低(P<0.01)，50%、70%洗脱馏分给药组均能降低海马和皮质中的ROS、MDA的水平，但50%洗脱馏分降低得更多(P<0.01，P<0.05)，50%、70%洗脱馏分给药组也能增加海马和皮质中抗氧化酶SOD(P<0.01)、CAT(P<0.01)、GSH-Px(P<0.05)的活性，而其它洗脱馏分的给药组则差异无统计学意义。

4 讨 论

远志主要含有皂苷类、山酮类、寡糖酯类、生物碱类、多糖类、黄酮类等化合物，远志中的皂苷类成分已经被证实具有抗老年痴呆活性[8]，而黄酮类化合物是一种广泛存在于花果蔬菜中的一类化合物，具有抗炎、清除自由基、治疗心血管系统疾病作用等生理活性[9]。远志中的皂苷类化合物大多为齐墩果烷型三萜皂苷，已有研究报道远志中有近百种远志皂苷，但其化学性质不稳定，遇酸极易水解[10]。国内外对远志的皂苷类成分的研究比较常见，大部分研究都是集中在采用不同类型的大孔吸附树脂对其皂苷类成分进行富集并进行含量的测定，且能得到较好的结果。但富集的皂苷类成分还含有一些其它类成分，且没有进行成分的测定。在本研究中，对富集后的总皂苷类的成分进行了黄酮类化合物的测定，且黄酮类化合物具有较好的抗老年痴呆活性，以区分其药效成分。

目前，临床上对于AD的治疗的药物主要是通过改善胆碱能系统功能来达到缓解AD的目的，但不能根治AD。现代研究表明，远志类的化学成分能抑制AD模型大鼠脑组织中的胆碱酯酶的活性，通过改善其胆碱能功能，改善AD模型小鼠或大鼠的学习记忆能力，从而达到治疗AD的目的[11]。但一直以来都未对其化学成分的类型进行分析。此外，远志也能改善D-半乳糖并联合使用ApoE4 双侧注射海马AD模型大鼠的大脑皮质及海马乙酰胆碱脂酶活力，提高脑组织中的乙酰胆碱水平[12]。

在正常生理条件下，机体内产生的氧自由基与机体内抗氧化酶清除自由基系统是平衡的，但当这种系统被破坏时，主要是机体内的抗氧酶活力降低时，体内的自由基水平就会增多，产生氧化应激损伤，氧化应激是造成神经细胞损伤，这是引起许多神经退行性疾病的重要发病机制，如阿尔茨海默症(AD)、帕金森病(PD)等。氧化应激还会导致脂质过氧化物MDA的水平增加，引起细胞损伤，使得机体快速进入衰老状态[13]。因此，清除自由基是延缓衰老的重要方法。本研究结果表明，远志黄酮及皂苷类成分不论在动物小鼠模型中能降低ROS和MDA的含量，清除多余的自由基，减少脂质过氧化；增加清除自由基酶SOD、CAT、GSH-Px的活力，增强机体自身清除自由基的能力，减少过氧化损伤，从而达到保护机体的目的。

本实验发现远志中皂苷类和黄酮类成分具有神经保护作用，对东莨菪碱诱导的记忆障碍模型有神经保护作用，连续给药21 d后，会降低小鼠海马和皮质中的ROS和MDA的含量，同样地会增加抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px的活力。以上结果充分说明了远志中的皂苷类和黄酮类成分具有神经保护的作用，在接下来的实验中，将进行进一步的实验来深入地来探讨其在神经保护方面的活性及其探究发挥疗效的可能物质。