血清microRNAs作为生物标志物用于子宫腺肌病分子诊断中的可行性

徐爱云 桂涛 黄美华 朱利 万贵平

[摘要] 目的 探讨血清microRNAs作为生物标志物用于子宫腺肌病分子诊断的可行性。 方法 选择2015年3月～2018年3月在江苏省中西医结合医院（以下简称“我院”）经病理学确诊的子宫腺肌病患者78例作为研究组，同时收集我院健康体检中心年龄、性别与子宫腺肌病组基本匹配的78名健康体检者作为对照组。利用高通量测序技术对两组血清中的所有miRNAs进行筛选和验证。 结果 研究组血清中microRNAs的表达水平与对照组差异有统计学意义（P < 0.05）。上调的miRNA个数为316个，下调的个数为24个。进一步筛选验证后发现3个miRNA包括miR-22-3p、miR-103a-3p、miR-182-5p的AUC分别是0.900（95%CI：0.839～0.961）、0.828（95%CI：0.747～0.909）、0.844（95%CI：0.766～0.921）。结论 血清microRNAs有可能成为诊断子宫腺肌病的生物标志物。

[关键词] 血清microRNAs；子宫腺肌病；生物标志物；分子诊断

[中图分类号] R711.4 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）05（b）-0008-04

The feasibility of serum microRNAs as biomarkers for molecular diagnosis of adenomyosis

XU Aiyun1 GUI Tao2 HUANG Meihua2 ZHU Li2 WAN Guiping2

1.The Third Clinical Medical College， Nanjing University of Chinese Medicine， Jiangsu Province， Nanjing 210023， China； 2.Department of Obstetrics and Gynecology， Jiangsu Provincial Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine， Nanjing University of Chinese Medicine， Jiangsu Province， Nanjing 210028， China

[Abstract] Objective To explore the feasibility of using serum microRNAs as biomarkers for the molecular diagnosis of adenomyosis. Methods Seventy-eight patients with adenomyosis confirmed by the pathological diagnosis from March 2015 to March 2018 in Jiangsu Provincial Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine （here in after referred to as "our hospital"） were selected as the study group. At the same time， 78 healthy subjects in our hospital physical examination center whose age， gender basically matched with the adenomyosis group were collected as the control group. All miRNAs in the serum of both groups were screened and validated using high-throughput sequencing technology. Results The expression level of microRNAs in the serum of the study group was significantly different from that in the control group （P < 0.05）. There were 316 up-regulated miRNAs and 24 down-regulated miRNAs. After further screening and verification， 3 miRNAs were found to include miR-22-3p， miR-103a-3p， and miR-182-5p， and AUC were 0.900 （95% CI： 0.839-0.961） and 0.828 （95% CI： 0.747-0.909）， 0.844 （95% CI： 0.766-0.921） respectively. Conclusion Serum microRNAs may be biomarkers for the diagnosis of adenomyosis.

[Key words] Serum microRNAs； Adenomyosis； Biomarkers； Molecular diagnosis

子宮腺肌病（adenomyosis，AM）是子宫内膜腺体和间质侵入子宫肌层，形成局部或弥漫性病灶的一种雌激素依赖性疾病[1]，好发于35～50岁的育龄女性[2]。子宫腺肌病的临床症状主要表现为经量过多、痛经甚至不孕，部分患者无明显症状[3]。由于超声、MRI、CT等影像学检查方法具有操作快捷等特点，仍是目前诊断子宫腺肌病的主要手段。然而，上述几种影像学诊断方法都各有所缺，经腹彩超检查使用的探头频率较低，经阴道彩超对操作者的技术要求较高，超声造影所使用的造影剂具有一定的副作用，MRI费用昂贵使其很难在临床上推广应用等等[4-7]。此外，子宫腺肌病误诊率较高，常被误诊为子宫肌瘤[8-9]。目前术后的病理学诊断仍是诊断子宫腺肌病的金标准[10]，但病理诊断通常在子宫全切术后进行，不适用于临床的常规检查。我们仍需要寻找一种早期、特异性高、敏感性高的新标志物。血清miRNA的发现为这一问题解决提供了可能。

血清miRNA是一类涉及癌症发展和进展的小型非编码性内源性RNA[11]。最早由Lee等[12]于1993年研究线虫发育时发现。2008年Lawrie等首先报道了人血清中含有miRNA[13]。近年来研究发现，miRNA广泛存在于人体血清及组织中，且具有较高的稳定性，miRNA通过多种途径参与肿瘤的发生、发展过程，并且肿瘤类型不同，miRNA的表达谱亦发生特异性变化[14-16]。因此，根据这些表达谱的特征性改变能够对某些疾病的生理病理现象进行分析从而进行诊断。提示miRNA在分子诊断中作为一类新的生物标志物，具有诊断子宫腺肌病的潜力。

本研究首先利用高通量测序技术对子宫腺肌病患者和正常对照的血清中的全部miRNAs进行筛选，选出与正常人相比患者血清中表达显著变化的miRNAs，然后运用实时荧光定量PCR技术（qRT-PCR）验证初筛的miRNAs，检测正常对照和患者血清中miRNAs的表达水平，最后利用ROC曲线分析和评价其诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

78例女性患者均为2015年3月～2018年3月在江苏省中西医结合医院的初诊患者，年龄35～50岁，入选标准为患者在入院之前均未经任何手术、药物等治疗。患者均行全子宫切除术且经组织病理学确诊。同时收集江苏省中西医结合医院健康体检中心年龄、性别与患者基本匹配的78名健康人血清作为对照。

1.2 观察指标及检测方法

1.2.1 样本收集及样本资料

样本收集均严格按照如下步骤进行：使用3 mL惰性分离胶促凝管收集患者和正常人全血，在室温下4000 g离心10 min去除血细胞并收集血清，然后将收集的血清在4℃条件下，16 000 g离心3 min，进一步去除残留的血细胞，离心后收集血清置于-80℃冰箱保存。随后运用qRT-PCR技术在剩余样本中对初筛miRNA分两个阶段进行复筛。运用高通量测序技术对血清miRNA进行初筛（包括30例子宫腺肌病患者，30例正常对照），随后运用qRT-PCR技术在剩余样本中对初筛miRNA进行验证（包括48例子宫腺肌病组，48名正常对照组）。见表1、2。

1.2.2 仪器与试剂

1.2.2.1 实验使用仪器 低速离心机（TD5，湖南赫西仪器装备有限公司）、高速冷冻离心机（5424R，Eppendorf）、超速离心机（BE-6100，海门市其林贝尔仪器制造有限公司）、涡旋仪（KB3，海门市其林贝尔仪器制造有限公司）、PCR仪（2720，Applied Biosystems）、qRT-PCR仪（7300，Applied Biosystems）。

1.2.2.2 实验试剂 氯仿（Simga）、异丙醇（南京化学试剂有限公司）、无水乙醇（南京化学试剂有限公司）、DEPC水（Simga）、醋酸钠（Ambion）、miRNA逆转录试剂盒（Applied Biosystems）、Taqman@MixⅡ（Applied Biosy？鄄stems）、miRNA反转录引物及探针（Applied Biosystems）。

1.2.3 高通量测序

总RNA样本检测合格后，首先对总RNA进行片段选择，通过胶分离技术收集18～30 nt或15～35 nt的RNA片段；在分离得到的RNA片段的两端分别连接上接头，然后反转录成cDNA，进行PCR扩增建立测序文库；最后，对检验合格的测序文库进行Illumina HiSeq高通量测序，采用SE50测序策略。

1.2.4 血清miRNA提取方法

将100 μL样品加入到300 μL水中，充分混匀后加入200 μL（pH = 4.7～5.5）酸性酚，剧烈震荡混匀后加入200 μL氯仿，再次充分震荡后16 000 g室温离心15 min。小心吸取上清液（约400 μL）加入到800 μL异丙醇中，再加入pH = 5.2，3 mol/L醋酸钠40 μL，充分混匀后-20℃静置1 h后，16 000 g，4℃离心20 min。充分弃上清后，加入75%乙醇1 mL，轻柔颠倒数次，16 000 g，4℃离心20 min。充分弃上清，室温干燥后，加入20 μL DEPC水溶解沉淀，-80℃低温冰箱保存。

1.2.5 RT-qPCR检测miRNA的表达

1.2.5.1 制备RT-PCR反应体系 100 mmol/L dNTPs 0.15 μL，Multi Scribetm RT 1.00 μL，10×TR 1.5 μL，RNA Inhibitor 0.19 μL，H2O 7.16 μL，RNA 2 μL，共计15 μL。反应条件：30 min，16℃；30 min，42℃；5 min，85℃。

1.2.5.2 制备RT-qPCR反應体系 TaqMan@Small RNA Assay（20×）1.0 μL，Product from RT reaction 2.0 μL，TaqMan@Unibersal PCR Master MixⅡ（2×）10 μL，H2O 7 μL，cDNA 2 μL，共计20 μL。反应条件：2 min，50℃；95 min，10℃；15 min，95℃；60 min，60℃。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；ROC曲线下面积和选定的cut off值进行计算计算miRNA的特异性和灵敏性。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 高通量测序

统计本次项目全部样本的差异表达miRNA上下调的个数，得到如下统计结果：在子宫腺肌病和正常对照血清中，上调的miRNA个数为316个，下调的个数为24个。

2.2 根据高通量测序结果挑选的microRNA

在AM组或者NC组中拷贝数至少大于200，两组比较时变化倍数大于等于5倍的miRNA被挑选出来。根据以上原则挑选了12个miRNAs进一步验证。见表3。

2.3 qRT-PCR技术对高通量测序验证结果

采用qRT-PCR技术在48例子宫腺肌病患者和48例对照组中对高通量测序显示的部分上调miRNA进行了验证。验证结果显示，有3种miRNA包括miR-22-3p、miR-182-5p、miR-103a-3p与高通量测序的变化趋势一致，在子宫腺肌病患者血清中显著性升高，结果见图1。由图1可知，miR-22-3p、miR-103a-3p、miR-182-5p在子宫腺肌病患者中表达量较对照组显著升高，3个miRNAs的变化差异有统计学意义（P < 0.05），为了分析血清miRNA对子宫腺肌病诊断的特异性和灵敏性，评估其临床价值。分别绘制3种血清miRNA的ROC曲线，miR-22-3p的AUC值为0.900（95%CI：0.839～0.961），miR-103a-3p的AUC值为0.828（95%CI：0.747～0.909），miR-182-5p的AUC值为0.844（95%CI：0.766～0.921）。见图2。

3 讨论

目前国内外学者对miRNAs与子宫内膜异位症的关系研究较多。子宫内膜异位症是指子宫内膜组织异位生长在子宫腔以外的部位，且具有恶性生物学行为，如细胞增生、侵袭和转移等[17]。研究发现[18-19]，子宫内膜异位症的发生发展与miRNA的表达失调有关。尽管子宫内膜异位症与子宫腺肌病在病理、生理及疾病进展方面显著不同，但二者在临床表现、疾病发生机制等方面有相似之处。然而，miRNAs与子宫腺肌病研究关系的研究较少。因此，miRNA与子宫腺肌病的关系值得深入研究。

本实验中，我们首先运用高通量测序技术对子宫腺肌病患者疾病发生发展过程中的全部血清miRNA表达谱进行了检测，发现340种miRNA在子宫腺肌病患者与对照之间存在差异（316种上调，24种下调），这就提示，子宫腺肌病发生发展过程中血清miRNA表达谱的显著不同提示血清miRNA可以作为子宫腺肌病发生发展进程的生物标志物。随后我们运用实时荧光定量PCR技术对筛选出来的12个上调miRNA进行更多样本的验证，发现子宫腺肌病患者血清中有3种高表达miRNA，包括miR-22-3p、miR-103a-3p、miR-182-5p。ROC曲线分析显示3个miRNAs的AUC的变化范围0.844～0.900。miR-22-3p、miR-103a-3p、miR-182-5p的AUC分别是0.900（95%CI：0.839～0.961）、0.828（95%CI：0.747～0.909）、0.844（95%CI：0.766～0.921）。这些结果提示了这3个miRNAs具有诊断子宫腺肌病的潜力，具有作为子宫腺肌病分子诊断标志物的可行性。

尽管目前血清miRNA作为生物标志物潜能成为新的分子生物学研究热点，但其来源尚不清楚。有研究证实[20]miRNA的主动分泌有两种形式，一种是游离的miRNA直接被细胞分泌；另一种则是miRNA先被选择性地包装在外泌体、微小体等膜性结构中，以包裹的形式从细胞分泌至胞外进入血循环。miRNA不同的分泌机制提示了这些miRNA很可能起源于细胞生长的不同阶段，并且因此有不同的命运和功能，目前还没有直接的证据表明，仍然需要进一步的研究。

本次研究证实miR-22-3p、miR-103a-3p、miR-182-5p可以作为子宫腺肌病早期诊断标志物，但仍需大样本、规范性的研究，以使研究结果更完善、更具有说服力。此外，这3个血清miRNA能否成为子宫腺肌病鉴别诊断的标志物，仍需要临床经验的积累和研究探索。

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（收稿日期：2018-03-26 本文編辑：任 念）