肝脏胰岛素抵抗在自发性糖尿病OLETF大鼠发病中的作用

李佳 薛耀明 潘永华 朱波 张燕

[摘要] 目的 通过观察包括肝脏脂肪沉积等在内的肝脏胰岛素抵抗（IR）指标在自发性2型糖尿病OLETF大鼠發病中的作用，探讨通过改善肝脏IR防治2型糖尿病的可行性。 方法 OLETF大鼠20只作为糖尿病组，LETO鼠10只作为正常对照组。定期口服葡萄糖耐量试验。分别于8、32、40周龄分批宰杀大鼠。检测血清各项血脂指标。分离肝脏，HE染色观察肝脏结组织学变化；根据HE结果，对32周龄及40周龄的OLETF组大鼠肝脏以冰冻切片进行脂肪及糖原的特异性染色，以进一步明确空泡样变性病变。 结果 OLETF组在23周龄首次出现糖耐量异常（IGT）4例，并有1例糖尿病发生；至40周龄时，OLETF组糖尿病发病率达92.9%。LETO组无IGT或糖尿病发生。自32周起，LETO组血清三酰甘油、胆固醇和游离脂肪酸均显著低于OLETF组（P < 0.05）。随着糖尿病病程进展，OLETF组大鼠肝脏空泡化加重，进一步完善脂肪及糖原特异性染色，提示肝脏脂肪浸润及糖原堆积渐进性加重；LETO组大鼠肝脏结构随着周龄延长无明显变化。 结论 肝脏IR在自发性糖尿病大鼠发病中发挥重要作用，改善肝脏IR可作为防治2型糖尿病的可能机制之一。

[关键词] 2型糖尿病；OLETF大鼠；肝脏胰岛素抵抗；脂肪异位沉积；脂代谢紊乱

[中图分类号] R587.4 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）05（b）-0012-05

The role of Hepatic insulin resistance in the pathogenesis of spontaneously diabetic OLETF rats

LI Jia1 XUE Yaoming2 PAN Yonghua2 ZHU Bo2 ZHANG Yan2

1.Department of Endocrinology， General Hospital of Guangzhou Military Command of PLA， Guangdong Province， Guangzhou 510010， China； 2.Department of Endocrinology and Metabolism， Nanfang Hospital， Nanfang Medical University， Guangdong Province， Guangzhou 510515， China

[Abstract] Objective To study the effects of hepatic insulin resistance， including the lipid deposition in livers， on preventing diabetes in Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty （OLETF） rats， and explore the probability of new mechanism in preventing diabetes in laboratory animals. Methods Twenty male spontaneous diabetic OLETF rats were treated as OLETF （group OLETF）. Ten male Long-Evans Tokushima Otsuka （LETO） rats were used as normal control group（group LETO）. Blood glucose is determined by oral glucose tolerance test. Rats were sacrificed at 8， 32 and 40 weeks and liver tissue isolated. Serum triglyceride， serum cholesterol， and serum free fatty acid （FFA） were determined. The morphological changes of livers were measured by HE stain. Based on HE results， frozen liver sections of OLETF rats of 32-week-old and 40-week-old respectively were stained with fatty Sudan Ⅲ as well as PAS before and after amylase digestion， the purpose of which is to further clarify the nature of the lesions. Results OLETF rats developed diabetes since 23 weeks of age and the incidence rate of diabetes became higher with the time goes by until got to 92.9% at 40 weeks of age when the research came to the end. No rats have developed diabetes or IGT in group LETO. The serum triglyceride， serum cholesterol， serum FFA was significantly lower in group LETO than that of group OLETF since 32 weeks （P < 0.05）. With the week age increasing， liver vacuolation in group OLETF became serious and it was suggested that there appeared a gradual increase on liver fat infiltration and glycogen accumulation with a further improvement on the specific staining of fat and glycogen； while there was no significant damage in the liver structure of group LETO. Conclusion Hepatic insulin resistance may play an important part in the onset of T2DM， and the improvement of hepatic insulin resistance may work as a probable mechanism of preventing diabetes.

[Key words] Type 2 diabetes； OLETF rats； Hepatic insulin resistance； Fat deposition； Lipid metabolism disorder

胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是目前公认的2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）发病的主要机制之一；而脂毒性在T2DM发病中的重要作用日益引起关注，有些学者甚至把糖尿病称为“糖脂病”[1-2]。肝脏作为中枢性胰岛素作用的靶器官，不仅通过参与糖原合成、分解、糖异生等环节在糖代谢中发挥重要作用，在脂代谢中也扮演重要角色。而肝脏IR除表现为我们熟知的肝糖生成增多外，还表现为脂代谢紊乱、肝脏脂肪沉积[3]。通过对T2DM发病机制的重新认识，我们认为通过改善脂代谢指标，减少肝脏脂肪沉积，改善脂毒性，继而改善肝脏IR，是防治T2DM不可忽视的重要环节。故本研究以国内外公认的优秀自发性T2DM模型（Otuska Long-Evans Tokushima Fatty，OLETF）鼠及其同种系糖耐量正常的对照鼠非糖尿病大鼠（Long-Evans Tokushima Otsuka，LETO）为研究对象[4-5]，通过观察糖、脂代谢指标、肝脏组织学改变、脂肪浸润、糖原化等方面，评价肝脏IR在T2DM发病中的作用，从改善肝脏IR的角度为T2DM防治提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物和分组 4周龄雄性OLETF鼠20只作为OLETF鼠糖尿病组（OLETF组），4周龄雄性LETO鼠10只作为正常对照组（LETO组）。均由日本大冢制药株式会社德岛研究所提供。

1.1.2 主要试剂和仪器 三酰甘油测定试剂盒：上海科欣生物公司；胆固醇测定试剂盒：上海科欣生物公司；游离脂肪酸测定试剂盒：南京建成生物工程研究所；Leica切片机：RM2135德国；双目显微镜及照相机：Olympus BX51+DP70日本；血糖仪及血糖试纸：One touch ultra美国强生公司。

1.2 方法

1.2.1动物饲养条件 大鼠在无特定病原体级（SPF）条件下单笼饲养，饲以标准饲料。环境温度控制在22～25℃，湿度为（55±5）%，12/12 h光照黑暗循环（光照时间为7：00～19：00），自由获取食物和饮水。

1.2.2血糖测定 分别于13、18、23、30、34、40周龄行口服葡萄糖耐量（OGTT）试验，剪尾法测定血糖值。血糖峰值>16.7 mmol/L和负荷后120 min血糖>11.1 mmol/L诊断为糖尿病，具备上述一条者为糖耐量异常[6]。

1.2.3 大鼠血液标本及肝脏组织采集 分别于8、32和40周龄随机（玻璃珠法）处死大鼠。术前禁食14 h，腹主动脉穿刺取血。各组大鼠宰杀后随机选取3只，分离肝脏组织，并分别置于液氮冻存及10%多聚甲醛中待检。

1.3 观察指标及检测方法

依次采用甘油磷酸氧化酶过氧化物酶法、铜离子显色法、胆固醇氧化酶过氧化物酶法检测血清三酰甘油（TG）、游离脂肪酸（FFA）、胆固醇（CHOL）水平。HE染色：以石蜡切片机间隔4 μm连续切片。相邻切片分别用标准HE染色观察大鼠肝脏组织学改变。苏丹Ⅲ染色观察各组大鼠肝脏脂肪变性情况。淀粉酶消化前后过碘酸Schiff染色（PAS）观察各组大鼠肝脏糖原蓄积病变。

1.3 统计学方法

采用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 OLETF大鼠及LETO大鼠OGTT结果

OLETF大鼠负荷后2 h血糖（2hPG）第23周龄较前有明显升高，显著高于13和18周龄血糖（P < 0.01），并随周龄增加而进一步升高。LETO组不同周龄2hPG差异无统计学意义（P > 0.05）。

18周龄以前两组间2hPG差异无统计学意义（P > 0.05）。23周龄起OLETF大鼠2hPG较LETO大鼠明显升高，两组间差异有统计学意义（P < 0.05），且这种差异随周龄增加进一步增大。见表1。

2.2 OLETF大鼠及LETO大鼠糖尿病发病情况

OLETF组在23周龄开始发生糖尿病，发病率随周龄延长而升高，40周龄发病率达92.9%。LETO组无糖尿病或糖耐量异常（IGT）发生。见图1。

2.3 OLETF大鼠及LETO大鼠脂代谢变化

8周龄时，OLETF组除血清CHOL水平较LETO组明显增高外，FFA和TG水平两组间差异无统计学意义（P > 0.05）。32周龄时，OLETF组血清FFA、TG、CHOL水平均较LETO组明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05），表现为明显的脂代谢紊乱。40周龄时，OLETF组TG、CHOL水平进一步升高，并且显著高于同周龄LETO组，差异均有统计学意义（P < 0.01）。见表2、图2。

2.4 OLETF大鼠及LETO大鼠肝脏组织学比较

8周龄时，两组大鼠肝脏结构无明显差别。32周龄，OLETF组大鼠肝细胞出现明显空泡样变性，而LETO组大鼠肝小叶结构依然整齐，肝细胞以中央静脉为中心排列成索状。40周龄，OLETF大鼠肝细胞空泡样变性更加明显，LETO组未见肝细胞空泡化。见图3。

A：LETO组32周；B：LETO组40周；C：OLETF组32周；D：OLETF组40周

图3 大鼠肝脏组织学变化（HE染色，600×）

2.5 OLETF大鼠肝细胞脂肪变性的苏丹Ⅲ染色

通过苏丹Ⅲ对脂肪特异性染色进一步证实，32周龄，OLETF组肝细胞出现大小泡混合的脂肪变性，并以小泡性脂肪变性为主；40周龄时，OLETF组肝细胞脂肪变性进一步发展，其中大泡性脂肪变性更多。见图4（封四）。

2.6 OLETF大鼠肝脏淀粉酶消化前、后的糖原特殊染色——PAS染色

32周龄，PAS染色后观察到OLETF组肝细胞的胞质可见丰富的红色颗粒，且核内空洞边缘、空洞内残留物质均呈红色，经过淀粉酶消化后PAS染色阴性，证明红色颗粒均为糖原颗粒；40周龄，OLETF组肝细胞中红色颗粒更加丰富，淀粉酶消化后PAS染色阴性证实为糖原。见图5（封四）。

3 讨论

过去的几十年间，我国成人体重指数不断增加，肥胖率及糖尿病患病率都随之增加。体脂增加是肥胖的糖尿病患者最重要的变化，也是糖尿病发生的关键因素；而相较于体脂增加，体脂的重新分布，尤其是在肝脏等脏器的异位沉积带来的危害更大。文献报道，肝脏脂肪沉积与IR发生密切相关，其对血糖的影响可能超过全身甚至是内脏脂肪的作用[7-8]。作为胰岛素作用的靶器官，肝脏通过维持能量平衡，在T2DM发生发展中的作用近年来被不断重新认可。在糖代谢方面，肝脏通过糖原分解与糖异生维持正常的空腹血糖；而餐后，肝脏通过糖原合成、抑制糖原分解等作用，降低餐后血糖。在脂代谢方面，餐后血脂的高低与肝功能关系密切；而T2DM患者肝脏IR的主要标志即肝糖原蓄积及TG释放增加。既往研究表明，通过高果糖饮食造模后，血浆TG和肝细胞内脂质间呈负相关关系，即血浆中TG升高，则肝细胞内脂肪沉积减少，认为TG的分泌可以暂时性的保护肝脏免受脂毒性[9]；而在临床工作中，我们看到大多数T2DM患者合并脂肪肝的同时，存在高甘油三酯血症。为了验证这一结论，提高研究结果的可靠性，本研究选用了自发性T2DM动物模型之一的雄性OLETF大鼠作为实验动物。由于其贪食，不喜运动和体形肥胖等特点，从8周龄起出现餐后血糖、血脂增高和高胰岛素血症，32周龄糖尿病发生率可高达90%[4-6]，与人类T2DM的病理生理进程极为相似，因此是观察T2DM发生发展的理想模型；但因为该种系大鼠价格昂贵、饲养条件要求高（SPF级，单笼饲养）、饲养周期长等原因，因此国内较少用此动物模型进行实验。在本研究中经过长达40周的觀察发现，OLETF组在23周龄开始出现糖尿病发病，发病率随时间延长逐渐升高，至40周龄时，发病率为92.9%，与国外文献报道一致[4]，表明OLETF鼠的饲养是成功的。LETO组则无IGT或糖尿病发生。随着周龄的延长，通过OGTT试验及血清中TG、FFA、CHOL等指标的检测，结合大鼠肝脏组织病理学变化，我们观察到随着时间的进展，糖尿病大鼠逐渐出现糖、脂代谢紊乱，与此同时其肝细胞内的脂质沉积也在逐渐进展，其糖原堆积亦随之进展，从体内试验明确了脂毒性在胰岛素抵抗、糖尿病发病中的重要作用[10-12]；同时也为改善脂毒性，继而改善肝脏IR，防治T2DM提供依据。

以往的研究显示，糖尿病引起的肝脏组织学变化可以表现为脂肪变性、糖原沉积、纤维增生、细胞水肿、炎症细胞浸润、Mallory小体等特异性及非特异性改变[13-14]。在本次研究中，通过对各组大鼠肝脏的HE染色观察到32周龄的OLETF组即出现明显的肝细胞空泡样变化，随着病程进展至40周龄，空泡变性进一步加重，而LETO组肝细胞结构始终未见紊乱。为明确空泡变性的性质，完善脂肪及糖原的特异性染色，发现OLETF组大鼠肝脏随着周龄的延长脂肪变性逐渐加重。有学者提出肝脏脂肪沉积本身就可以导致T2DM，在实验鼠肝脏中脂蛋白脂肪酶定向过度表达，实验鼠肝脏即可出现与特异性IR相关的脂肪沉积[15]；相反，在高脂饲养的脂肪肝大鼠中发现，在肥胖出现之前，就已经发生了肝脏的IR现象；而二硝基苯酚通过促进线粒体解偶联，可以防止肝脏脂肪沉积，利用其治疗脂肪肝这一特点，治疗高脂饲养的实验鼠，再次验证了肝脏脂肪沉积在介导IR中发挥的重要作用[3]。另一方面，Fruci等[3]发现，肝脏脂肪沉积导致胰岛素抑制肝内葡萄糖合成的能力减弱，说明肝脏IR的存在，同时导致葡萄糖分解减少约一半，则说明全身胰岛素敏感性下降。此外肝脏脂肪沉积还使胰岛素介导的脂解作用减弱，导致进入肝脏的FFA增加并抑制其氧化，使肝脏对作为能量来源的葡萄糖的摄取及利用减少，此即肝脏的IR[16]，而FFA本身就是重要的致IR物质[11]。

而通过对糖原的PAS染色及淀粉酶消化的对照，观察到随着病程进展，OLETF组肝细胞胞浆中糖原蓄积、胞核空洞化逐渐加重，从形态学上验证了糖尿病大鼠糖代谢障碍，糖原堆积于肝细胞胞浆中，甚至有糖原进入肝细胞核，导致并加重肝脏IR，而其同种系糖耐量正常LETO大鼠没有上述变化[17-19]。文献显示，T2DM患者血清FFA升高[1]，FFA进入肝细胞可转变为脂肪代谢产物甘油二酯等，进一步激活丝/苏氨酸激酶、核转录因子-κB（NF-κB）/NF-κB抑制物激酶β（IKKβ）等炎症通路[20-24]，引起级联炎性反应，从而加重IR，加重糖代谢紊乱。故糖脂代谢紊乱是糖尿病发病的基础，而肝脏IR贯穿其发病始终。因此降低血清FFA，继而减少脂肪在肝脏异位沉积，改善肝脏的脂肪变性程度，从而减轻肝脏的“脂毒性”，最终减少肝糖原分解，可作为减少糖尿病发生的靶点之一。

肝脏的脂肪沉积与T2DM孰因孰果一直是近年来争论的焦点[25-26]，IR通过影响脂蛋白酯酶，继而干扰脂肪酸代谢，导致脂肪在肝脏异常堆积引起脂肪肝，而肥胖相关的大多数非酒精性脂肪性肝病因脂肪异常沉积于肝脏，导致IR，机体代偿分泌胰岛素增多，最终导致胰岛β细胞衰竭，引起血糖升高。与文献报道一致[27-28]，临床上我们也观察到脂肪肝严重程度是影响T2DM患者血糖控制良好与否的因素之一，其与日胰岛素剂量等密切相关。因此，重新认识肝脏在T2DM发生中的作用，了解肝脏脂肪沉积，肝脏IR在糖脂代谢中的重要作用为我们防治糖尿病提供新的视角。在我们的后期研究中，我们计划进一步探索肝脏IR的相关信号转导通路，通过分析肝组织胰岛素信号转导通路与糖、脂代谢相互关系，从改善肝脏IR角度深入探讨预防治T2DM的新机制。

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（收稿日期：2018-01-29 本文編辑：任 念）