柱前衍生HPLC-UV法测定类风湿性关节炎大鼠尿样中16种氨基酸含量

马桂芝， 陈雪珊， 蒋思思， 段 霞

(新疆医科大学1药学院； 2科学技术处， 乌鲁木齐 830011； 3第一附属医院， 乌鲁木齐 830054；4新疆维吾尔自治区第一济困医院药剂科， 乌鲁木齐 830017)

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种原因未明且多发的全身自身免疫性疾病，其基本病理改变是滑膜慢性炎症及关节软骨和骨质的破坏，临床特征为关节结构的炎症和肿胀、慢性进行性病程，并可致多个关节完全强直，最终导致功能的丧失。RA具有发病率、致残率高的特点，是严重危害人类健康的主要疾病之一[1]。近年来，代谢组学在类风湿性关节炎疾病的诊断和小分子生物标记物研究应用方面日趋广泛[2-3]，根据代谢组学方法和动物疾病模型相结合的研究思路，重点采用相关检测技术考察类风湿性关节炎形成过程中的内源性小分子代谢物，有助于寻找可能的类风湿性关节炎标志物，诠释疾病发病可能的机制[4-5]。本课题组在前期研究中已完成类风湿性关节炎大鼠模型的制备，在此基础上，本研究建立了柱前衍生高效液相色谱-紫外分光光度(柱前衍生-HPLC-UV)法测定类风湿性关节炎大鼠尿样中16种氨基酸的含量，现报道如下。

1 仪器及试药

1.1仪器LC-20AB高效液相色谱仪(日本岛津公司)；XS205电子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)。

1.2试药色谱甲醇(sigma-Aldrich公司)；色谱乙腈(sigma-Aldrich公司)；异硫氰酸苯酯(PITC)(东京化成工业株式会社)；天冬氨酸(Asp，上海源叶生物科技有限公司，批号S24A8I34463)、谷氨酸(Glu，上海源叶生物科技有限公司，批号YY91069)、丝氨酸(Ser，上海源叶生物科技有限公司，批号SM0503GC13)、甘氨酸(Gly，上海源叶生物科技有限公司，批号SM0315GA14)、谷氨酰胺(Gln，上海源叶生物科技有限公司，批号YY91070)、牛磺酸(Tau，上海源叶生物科技有限公司，批号108K1305V)、组氨酸(His，上海源叶生物科技有限公司，批号060M8201V)、丙氨酸(Ala，上海源叶生物科技有限公司，批号S20A6G17672)、精氨酸(Arg，上海源叶生物科技有限公司，批号MKBD3032V)、脯氨酸(Pro，上海源叶生物科技有限公司，批号S30J6G1)、酪氨酸(Tyr，上海源叶生物科技有限公司，批号YY91110)、缬氨酸(Val，上海源叶生物科技有限公司，批号081M00551V)、蛋氨酸(Met，上海源叶生物科技有限公司，批号SLBK1770V)、异亮氨酸(Iso，上海源叶生物科技有限公司，批号SM0503GD13)、亮氨酸(Leu，上海源叶生物科技有限公司，批号S05M8I35309)、犬尿氨酸(Kyn、东京化成工业株式会社，批号K0016)、苯丙氨酸(Phe Kyn，东京化成工业株式会社，批号A5513)、色氨酸(Try，上海源叶生物科技有限公司，批号S02D7I26049)、赖氨酸(Lys，上海源叶生物科技有限公司，批号S26A8I34751)、高胱氨酸(Hcy、上海源叶生物科技有限公司，批号YY20109)；其他试剂均为分析纯。

1.3实验动物SPF级Wistar雄性大鼠，体质量(200±2) g，由新疆医科大学实验动物中心提供，动物合格证号 SCXK(新)2011-0004。动物饲养室温度20℃～25℃，湿度(50±10)%。

2 方法与结果

2.1大鼠关节炎模型的制备与尿样采集取牛Ⅱ型胶原10 mg，加入0.1 mol/L醋酸5 mL充分溶解，配制成2 mg/mL溶液，4℃过夜备用。取弗氏完全佐剂5 mL，加入5 mL 2 mg/mL牛Ⅱ型胶原溶液混合乳化。于右后足趾部皮内注射0.1 mL乳化液进行初次免疫后，于第7天相同剂量尾根部加强注射1次。

2.2色谱条件色谱柱：COSMOSIL 5C18-MS-Ⅱ(250 mm×4.6 mm×4.6 μm)，流动相A：乙腈-甲醇-水(6 ∶2 ∶2)，混合均匀后用0.45 μm滤膜过滤，流动相B：称取7.6 g无水乙酸钠，溶于1 000 mL蒸馏水中，超声溶解后用冰醋酸调pH为6.5，混合均匀后用0.45 μm滤膜过滤。 线性梯度洗脱程序：0.01 min，95%B；7 min，94%B；20 min，90%B；30 min，88%B；40 min，75%B；45 min，70%B；55 min，65%B；65 min，48%B；70 min，0%B；75min，50%B；80 min，95%。柱温35℃，检测波长254 nm，流速1.0 mL/min，进样量10 μL。

2.3氨基酸混合标准溶液配制将19种氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、牛磺酸、组氨酸、丙氨酸、精氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、犬尿氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、赖氨酸)用0.1 mol/L HCL溶液溶解分别配制成各氨基酸浓度为10 mg/mL的储备液，4℃冰箱放置备用。

2.4尿样处理方法尿样从-80℃冰箱中取出后置于冰袋上溶化，4℃下15 000 r/min 离心15 min，取上清液200 μL至2 mL EP管中，加1 mol/L三乙胺-乙腈溶液100 μL，0.1 mol/L PITC-乙腈溶液100 μL，混匀，室温放置50 min，加入正己烷400 μL，震荡后15 000 r/min 离心5 min，取下层溶液，经0.22 μm滤膜过滤后按“2.2”项下色谱条件进行测定分析。

2.5色谱系统适用性分别取200 μL 50 μg/mL氨基酸混标溶液、200 μL 0.1 mol/L HCL、200 μL空白尿样按“2.4”项下方法处理，进样分析。在此色谱条件下19种氨基酸达到基线分离，分离度良好，峰形对称，预处理残留衍生化试剂与待测氨基酸分离度良好，不干扰氨基酸的定量测定，见图1-3。

图1 氨基酸对照品溶液HPLC色谱图

图2 空白试剂HPLC色谱图

图3 尿样中氨基酸HPLC色谱图

注：1天冬氨酸(Asp),2谷氨酸(Glu),3丝氨酸(Ser),4甘氨酸(Gly),5谷氨酰胺(Gln),6组氨酸(His),7牛磺酸(Tau),8精氨酸(Arg),9丙氨酸(Ala),10脯氨酸(Pro),11酪氨酸(Tyr),12缬氨酸(Val),13蛋氨酸(Met),14异亮氨酸(Iso),15亮氨酸(Leu),16犬尿氨酸(Kyn),17苯丙氨酸(Phe),18色氨酸(Try),19赖氨酸(Lys)

2.6方法学考察

2.6.1 线性范围和检测限 精密移取氨基酸混标储备液，梯度稀释，按“2.4” 项下方法处理，采用“2.2”项下色谱条件进行分析，以各氨基酸峰面积为纵坐标，浓度为横坐标进行线性回归，以信噪比(S/N)=3对应各氨基酸的浓度为检测限。13种氨基酸在其相应的线性范围内相关性良好(0.995 9～0.999 7)，见表1。

表1 氨基酸对照品线性范围及检测限结果(n=5)

2.6.2 精密度及准确度实验 取已知各氨基酸浓度的空白尿样样品，加入高、中、低3个浓度的混标溶液(n=5)，按“2.4”项下方法处理，按“2.2”项下色谱条件进行分析，记录峰面积，计算各氨基酸浓度、相对标准偏差及回收率。结果 13种氨基酸在线性范围内回收率良好，回收率在85%～115%，准确度良好，RSD均小于15%，见表2。

表2 回收率和精密度试验结果(%， n=5)

2.6.3 稳定性实验

2.6.3.1 样品溶液15 h内的稳定性 取空白尿样，按“2.4”项下方法处理后的样品溶液于0、2、4、6、9、12、15 h进样分析，记录氨基酸峰面积，计算各氨基酸浓度及相对标准偏差。结果13种氨基酸在15 h内稳定性良好，RSD均小于15%，见表3。

2.6.3.2 尿样在30 d内的稳定性 将空白尿样存放-80℃冰箱，于第0天，第10天和第30天取样，按“2.4”项下方法处理，采用“2.2”项下色谱条件进行分析，记录氨基酸峰面积，计算各氨基酸浓度及相对标准偏差。结果表明13种氨基酸在40 d内稳定性良好，RSD均小于15%，见表4。

表3 大鼠尿样中氨基酸15 h稳定性结果(μg/mL)

表4 大鼠尿样中氨基酸30 d内稳定性结果

2.7大鼠尿中氨基酸的含量测定分别取大鼠造模前后的尿液，4℃低温5 000 r/min离心 15 min，取上清液，按“2.4”项下方法处理，采用“2.2”项下色谱条件测定，记录氨基酸峰面积，计算各氨基酸浓度，见表5。

3 讨论

3.1衍生方法的选择氨基酸的衍生方法有邻苯二甲醛(OPA)法、6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯(AQC)法、2，4-二硝基氟苯(DNFB)法、异硫氰酸苯酯(PITC)法等[6-9]，其中6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯(AQC)法和2，4-二硝基氟苯(DNFB)法适用于荧光检测器检测，邻苯二甲醛(OPA)法虽在紫外和荧光检测器下均可检测到，但其衍生产物具有不稳定性(某些氨基酸信号衰减较快)，异硫氰酸苯酯(PITC)衍生方法是常用的氨基酸衍生法，方法重现性好，衍生产物较稳定，灵敏度高，因此被广泛应用与氨基酸样品的测定当中，因此本试验确定采用异硫氰酸苯酯(PITC)法进行样品中氨基酸的衍生。

表5 尿样中各氨基酸浓度

3.2液相色谱条件的摸索本试验考察了COSMOSIL Cholester色谱柱、5C18-MS-II色谱柱对尿样中氨基酸分离的效果，COSMOSIL Cholester胆固醇基色谱柱是固定相键合了胆固醇基的反相色谱柱，对疏水化合物有较强的立体选择性，在与ODS相同的分析条件下分离效果与重现性均更好，可带来更好的可重现的分析结果。最终选用COSMOSIL 5C18-MS-II色谱柱作为尿样中氨基酸分析的的色谱柱。