独一味胶囊对复发性口腔溃疡大鼠血清TNF-α、IL-2和IL-6水平的影响

杨 敏， 柳志文

(1中南大学湘雅二医院， 湖南 长沙 410011； 2长治医学院附属和平医院口腔科， 山西 长治 046000)

近年来，随着生活节奏快速化，饮食结构发生很大改变，人体日常摄入维生素量减少，显著增加患口腔溃疡风险[1]。临床调查发现，复发性口腔溃疡(recurrent oral ulcer，ROU)在人群中发病率高达20%，ROU属于口腔黏膜中常见疾病，患病部位多出现独立、近圆形浅表溃疡，常伴有充血水肿、灼痛感明显、易复发等典型症状，严重者可影响患者饮食或使其发生语言障碍，根治困难，给患者生活及工作带来诸多不便[2]。ROU发病多伴随机体T淋巴细胞失衡引起的炎症反应及免疫系统紊乱，以致病情反复，迁延难愈。目前现代医学治疗ROU以对症治疗为主，通过使用抗生素、补充维生素等减轻ROU炎症症状，减少发病次数，但根治较为困难，且易产生副作用。

中医认为ROU与素体阴虚、脾胃湿热或阳虚等有关，中医利用辩证论治法治疗ROU具有显著效果。独一味胶囊属于中医常用药材，具有消炎止痛、活血抑菌、增加机体免疫力等功效[3]。目前关于独一味胶囊的研究集中于术后止痛、关节炎等相关疾病上[4-5]，关于其用于治疗ROU效果及机制研究尚少。基于此，本研究通过建立ROU大鼠模型，观察独一味胶囊治疗效果，并对其作用机制进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1实验动物SPF级雄性SD大鼠，40只，体质量180～220 g，购自上海斯莱克实验动物有限公司。

1.2药物独一味胶囊(生产厂家：甘肃独一味生物制药有限责任公司；批准文号：国药准字Z10970053；规格：0.3 g/粒)。

1.3主要试剂及仪器TNF-α、IL-2、IL-6酶联免疫吸附试剂盒(武汉默沙克生物科技有限公司)，兔抗鼠TNF-α、IL-6，山羊抗兔TNF-α、IL-6，山羊抗鼠IL-2、兔抗IL-2(Abcam公司)，全自动酶标仪(Thermo公司)、电泳仪(Bio-Rad公司)。

1.4方法

1.4.1 模型建立及分组 40只大鼠脊柱两侧剃毛后消毒，两侧皮内注射完全弗氏佐剂0.1 mL，7 d注射1次，共3次。定期观察大鼠口腔黏膜变化，最后一次给药7 d后40只大鼠均出现口腔溃疡，模型建立成功。将40只口腔溃疡大鼠模型随机分为4组，每组10只。低、中、高剂量组大鼠按照1 mL/100 g分别灌服低、中、高剂量独一味胶囊溶液(独一味胶囊内容物用无菌生理盐水配置浓度为5%、10%、15%溶液)，对照组灌服1 mL/100 g无菌生理盐水，每天给药3次，每次间隔4 h，连续灌服7 d。各组自由饮水进食。

1.4.2 溃疡数目及面积测定 各组大鼠分别在给药后1 d、3 d、7 d，按1 mL/100 g腹腔注射0.3 %戊巴比妥钠进行麻醉，统计溃疡数目，并用游标卡尺测量溃疡最大横径(D1)、最大纵径(D2)，计算溃疡面积=0.25×π×D1×D2(π=3.14)。

1.4.3 各组血清TNF-α、IL-2和IL-6水平检测 各组分别在给药后1 d、3 d、7 d，尾静脉采血，室温静止2 h，3 000 r/min离心10 min，收集上层血清。严格按照酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒说明书步骤，酶标仪在450 nm波长下测定各组血清肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素2(Interleukin 2，IL-2)及白介素6(Interleukin 6，IL-6)吸光光度(OD)值，根据标准曲线计算血清TNF-α、IL-2和IL-6含量。

1.4.4 黏膜组织TNF-α、IL-2和IL-6蛋白相对表达量测定 各组分别在给药后7 d，采血后CO2处死，取口腔黏膜组织置于离心管，加入1×PBS进行匀浆，按照蛋白提取试剂盒说明书提取总蛋白，BCA进行蛋白定量测定后，各泳道进样20μL，进行SDS-PAGE电泳分离，电转 2 h后蛋白转入硝酸纤维素膜。封闭液孵育2 h，加入一抗(1∶500)，4℃摇床过夜，加入二抗(1∶10 000)，常温孵育1.5 h，暗室中曝光、显影及定影。采用凝胶成像软件系统扫描拍照，使用Image J软件对图片进行灰度值分析，分别用TNF-α、IL-2和IL-6灰度值与内参β-action灰度值比值表示蛋白相对表达量。

1.5观察指标(1)各组大鼠给药前及给药后第1、3、7天时溃疡数目及面积对比；(2)各组大鼠给药前及给药后第1、3、7天时血清TNF-α水平对比；(3)各组大鼠给药前及给药后第1、3、7天时血清IL-2水平对比；(4)各组大鼠给药前及给药后第1、3、7天时血清IL-6水平对比；(5)各组大鼠给药后第7天黏膜组织TNF-α、IL-2和IL-6蛋白相对表达量对比。

2 结果

2.1各组大鼠给药不同时刻溃疡数目及面积比较各组大鼠给药后溃疡数目及面积组间、时间及交互比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。低、中、高剂量组给药后溃疡数目及面积均显著低于对照组(P<0.05)，中剂量组及高剂量组给药后溃疡数目及面积均显著低于低剂量组(P<0.05)，高剂量组给药后溃疡数目及面积显著低于中剂量组(P<0.05)；低、中、高剂量组给药后3 d、7 d溃疡数目及面积均显著低于给药1 d(P<0.05)，低、中、高剂量组给药后7 d溃疡数目及面积均显著低于给药3 d(P<0.05)，对照组给药后各时刻溃疡数目及面积差异无统计学意义(P>0.05),结果见表1。

表1 各组给药1、3、7 d大鼠溃疡数目及面积变化比较

注：与对照组比较，aP<0.05； 与低剂量组比较，bP<0.05； 与中剂量组比较，cP<0.05； 与给药1 d比较，dP<0.05； 与给药3 d比较，eP<0.05。

2.2各组大鼠给药不同时刻血清TNF-α水平比较各组大鼠给药后血清TNF-α水平组间、时间及交互比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。低、中、高剂量组给药后血清TNF-α 水平均显著低于对照组(P<0.05)，中剂量组及高剂量组给药后血清TNF-α水平均显著低于低剂量组(P<0.05)，高剂量组给药后血清TNF-α水平显著低于中剂量组(P<0.05)；低、中、高剂量组给药后3 d、7 d血清TNF-α水平均显著低于给药1 d(P<0.05)，低、中、高剂量组给药后7 d血清TNF-α水平均显著低于给药3 d(P<0.05)，对照组给药后各时刻血清TNF-α水平差异无统计学意义(P>0.05),结果见表2。

表2 各组大鼠血清TNF-α水平变化比较(ng/L， ±s)

注：与对照组比较，aP<0.05； 与低剂量组比较，bP<0.05； 与中剂量组比较，cP<0.05； 与1 d比较，dP<0.05； 与3 d比较，eP<0.05。

2.3各组大鼠给药不同时刻血清IL-2水平比较各组大鼠给药后血清IL-2水平组间、时间及交互比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。低、中、高剂量组给药后血清IL-2水平均显著高于对照组(P<0.05)，中剂量组及高剂量组给药后血清IL-2水平均显著高于低剂量组(P<0.05)，高剂量组给药后血清IL-2水平显著高于中剂量组(P<0.05)；低、中、高剂量组给药后3 d、7 d血清IL-2水平均显著高于给药1 d(P<0.05)，低、中、高剂量组给药后7 d血清IL-2水平均显著高于给药3 d(P<0.05)，对照组给药后各时刻血清IL-2水平差异无统计学意义(P>0.05),结果见表3。

表3 各组大鼠血清IL-2水平变化比较(ng/L， ±s)

注：与对照组比较，aP<0.05； 与低剂量组比较，bP<0.05； 与中剂量组比较，cP<0.05； 与给药1 d比较，dP<0.05； 与给药3 d比较，eP<0.05。

2.4各组大鼠给药不同时刻血清IL-6水平比较各组大鼠给药后血清IL-6水平组间、时间及交互比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。低、中、高剂量组给药后血清IL-6水平均显著低于对照组(P<0.05)，中剂量组及高剂量组给药后血清IL-6水平均显著低于低剂量组(P<0.05)，高剂量组给药后血清IL-6水平显著低于中剂量组(P<0.05)；低、中、高剂量组给药后3 d、7 d血清IL-6水平均显著低于给药1 d(P<0.05)，低、中、高剂量组给药后7 d血清IL-6水平均显著低于给药3 d(P<0.05)，对照组给药后各时刻血清IL-6水平差异无统计学意义(P>0.05),结果见表4。

表4 各组大鼠血清IL-6水平变化比较(ng/L， ±s)

注：与对照组比较，aP<0.05； 与低剂量组比较，bP<0.05； 与中剂量组比较，cP<0.05； 与给药1 d比较，dP<0.05； 与给药3 d比较，eP<0.05。

2.5各组大鼠黏膜组织TNF-α、IL-2和IL-6蛋白相对表达量比较各组大鼠给药7 d后口腔溃疡黏膜组织中TNF-α、IL-2及IL-6蛋白相对表达量比较，差异均有统计学意义(F=237.932，P=0.000；F=200.235，P=0.000；F=429.156，P=0.000)。低、中、高剂量组TNF-α及IL-6蛋白相对表达量均显著低于对照组(TNF-α：t=9.940，P=0.000；t=16.054，P=0.000；t=22.981，P=0.000；IL-6：t=15.310，P=0.000；t=25.681，P=0.000；t=41.110，P=0.000)，中剂量组及高剂量组TNF-α及IL-6蛋白相对表达量均显著低于低剂量组(TNF-α：t=7.016，P=0.000；t=16.500，P=0.000；IL-6：t=9.391，P=0.000；t=18.439，P=0.000)，高剂量组TNF-α及IL-6蛋白相对表达量显著低于中剂量组(t=8.396，P=0.000；t=12.021，P=0.000)；低、中、高剂量组IL-2蛋白相对表达量均显著高于对照组(t=25.931，P=0.000；t=19.616，P=0.000；t=22.667，P=0.000)，中剂量组及高剂量组IL-2蛋白相对表达量均显著高于低剂量组(t=4.243，P=0.000；t=8.669，P=0.000)，高剂量组IL-2蛋白相对表达量显著高于中剂量组(t=3.939，P=0.001),结果见图1、2。

图1 各组大鼠口腔溃疡黏膜组织TNF-α、IL-2及IL-6蛋白表达情况

3 讨论

近年来研究发现ROU发病病因与免疫、遗传及环境因素有关，但关于其致病机理尚未明确[6]。ROU患者机体炎症反应及免疫功能易发生紊乱，而辅助性T细胞(helper T cell，Th1)通过分泌IL-2、IL-6调节机体免疫力，TNF-α可调控细胞免疫反应，该类炎症反应因子共同作用，参与ROU进展。临床上大部分通过使用糖皮质激素类药物缓解症状、服用免疫调节剂改善机体免疫反应等对症治疗[7]，虽然短期内能够缓解溃疡症状，但长期服用副作用大，尤其是长期使用激素类药物可引起高血压、内分泌紊乱、消化道溃疡，严重者可致穿孔，且对ROU复发情况较难控制，因此选择安全、有效的药物进行治疗十分重要。

图2 各组大鼠黏膜组织TNF-α、IL-2和IL-6蛋白相对表达量

本研究发现，低、中、高剂量组给药后溃疡数目及溃疡面积均显著低于对照组(P<0.05)，且低、中、高剂量组溃疡数目及溃疡面积均呈时间及剂量依赖性降低(P<0.05)，但对照组均无统计学差异(P>0.05)。说明不同剂量独一味胶囊可有效改善ROU症状，与徐斌等[8]关于中药独一味口腔贴膜在口腔溃疡治疗中的效果研究结果类似。中医认为，ROU发病机理为湿热上循、燥邪伤津；情志过度、思虑过极、郁而化火、灼熏口舌；素体阴虚、虚火上灼口舌，均可导致“口疮”即口腔溃疡发生[9]。独一味属于唇形科植物，其根茎及全草均可入药，是藏、蒙、纳西等民族民间常用药材之一。研究发现，独一味胶囊在各种原因所致出血、炎症疼痛的治疗中均有显著疗效，同时安全性好[10]。由此可知，独一味胶囊中的有效成分可使溃疡面加速愈合，有效治疗ROU。

本研究发现，低、中、高剂量组给药后血清TNF-α、IL-6水平及口腔溃疡黏膜组织中蛋白相对表达量均显著低于对照组(P<0.05)，且低、中、高剂量组均呈时间及剂量依赖性降低(P<0.05)，但对照组血清TNF-α、IL-6水平无统计学差异(P>0.05)，说明独一味胶囊可有效减少大鼠血清及口腔黏膜组织中炎症因子TNF-α、IL-6表达量，有效缓解炎症反应。TNF-α主要由单核巨噬细胞、T淋巴细胞分泌，在机体中广泛存在，TNF-α与其受体可特异性结合并调控细胞因子，从而参与细胞增殖、凋亡及促进各类炎症进展过程[11]。IL-6同样作为炎症反应重要细胞因子，与TNF-α共同参与调节机体免疫反应[12]。研究发现，在NF-κB介导的免疫应答及炎症反应中，NF-κB激活后可促进炎症相关因子TNF-α、IL-6的转录及表达，TNF-α、IL-6又可反馈调节NF-κB信号通路，故检测NF-κB信号通路的下游产物TNF-α、IL-6血清及组织中的表达量对判断病情有重要作用[13]。药理实验研究发现，从独一味根茎或叶中提取的槲皮素、独一味素及芹菜素等具有较强生物活性成分，具有活血化瘀、抗炎止痛功效，且可有效改善机体免疫力[14]。独一味胶囊可有效降低血清中及溃疡组织中的损伤性细胞因子TNF-α及IL-6水平，进而减轻组织损伤程度。

本研究发现，低、中、高剂量组给药后血清IL-2水平及口腔溃疡黏膜组织中蛋白相对表达量均显著高于对照组(P<0.05)，且低、中、高剂量组均呈时间及剂量依赖性升高(P<0.05)，但对照组血清IL-2水平无统计学差异(P>0.05)。说明独一味胶囊可显著提高大鼠血清及口腔黏膜组织中炎症因子IL-2表达量。IL-2主要由活化的T淋巴细胞产生，是重要的免疫调控及监视因子[15]。IL-2与IL-2受体结合后可激活Jak/STAT、MEK/ERK等多条信号通路，诱导淋巴细胞大量增生，同时可使自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)活性增强，使B淋巴细胞分泌免疫球蛋白能力增强，最终增强机体免疫应答[16]。独一味中主要化学成分环烯醚萜苷由胃黏膜迅速进入机体，刺激炎症因子IL-2快速释放，使血清及组织中IL-2水平显著增加，提高机体免疫应答速度，最终可使创面加速愈合[17]。独一味胶囊使口腔溃疡大鼠血清及组织中IL-2表达量显著提高，机体免疫应答反应及口腔溃疡组织修复能力增强，最终显著改善ROU症状。

综上所述，独一味胶囊可显著减少大鼠口腔溃疡数目及溃疡面积，促进大鼠口腔溃疡黏膜修复，加速愈合，推测与独一味胶囊显著下调TNF-α、IL-6在血清及口腔溃疡黏膜组织中的表达及上调IL-2的表达有关。独一味胶囊通过调节TNF-α、IL-6及IL-2，控制ROU病情进展，为临床中治疗ROU提供新的简单有效治疗方法。