高活菌型牛羊奶混合发酵乳的工艺优化

单静，常小静，康晓静，艾春梅，赵彦珺，万腾腾，姜竹茂

（1.烟台大学生命科学学院，山东烟台264005；2.河南三剑客农业股份有限公司，河南漯河462000）

0 引 言

羊奶作为一种比较独特且又营养丰富的乳品资源，含有200多种营养物质和生物活性物质，被称为“奶中之王”，但由于其风味缺陷一直难以被消费者接受，严重制约了羊奶资源的开发利用[1-3]。牛羊奶混合发酵乳是以牛奶和羊奶为原料，在添加低聚果糖的基础上由微生物发酵制成的一种高活菌型乳制品，具有更高的钙含量及更强的保水能力[4]，明显优于仅有牛奶或羊奶发酵制备的发酵乳。且经过乳酸菌发酵后可以明显改善羊奶风味，赋予混合发酵乳一种独特口感，有益于推动羊奶市场的发展。

低聚果糖作为一种对多数益生菌增殖作用较明显的益生元，可以促进乳品发酵，明显缩短发酵时间，改善发酵乳的口感及稳定性，并有效抑制肠道内有害菌群的侵染定植，提高机体免疫力[5-10]。本文在添加低聚果糖的基础上，研究各因素对牛羊奶混合发酵乳感官品质的影响，进而生产出一种含有高活菌数新型发酵乳制品。

1 实验

1.1 材料与试剂

牛奶，羊奶，保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌，低聚果糖，MRS固体培养基（自制），蔗糖等。

1.2 仪器与设备

CR J-0.03/60型均质机，FA 1004型电子天平，EM-30型磁力搅拌水浴锅，DNP-9082型电热恒温恒湿培养箱，SW-CJ-ID型超净工作台，ZBM 1380HPA型冰箱。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程

1.3.2 高活菌型牛羊奶混合发酵乳制备要点

（1）牛羊奶混合比例的确定。牛羊奶分别以3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3的比例混合，添加7%的蔗糖与1.2%的低聚果糖，预热均质杀菌后，接种2.5%的发酵剂，于42℃恒温培养箱中发酵7 h，经后熟处理后通过感官评价确定最佳混合比例。

（2）低聚果糖添加量的确定。由于低聚果糖对益生菌具有较好的增殖作用，可以明显缩短发酵时间，改善发酵乳的风味。因此以牛羊奶混合比例2:1，蔗糖添加量7%，低聚果糖添加量（0，0.3%，0.6%，0.9%，1.2%，1.5%），预热均质杀菌后，接种2.5%的发酵剂，于42℃恒温培养箱中发酵7 h，经过后熟处理后分析不同低聚果糖添加量对牛羊奶混合发酵乳感官品质的影响以及在4℃条件下贮藏21 d内活菌数的变化趋势，并确定低聚果糖的最佳添加量。

1.3.3 单因素实验

在其他因素不变的情况下，依次选取蔗糖添加量（3%，5%，7%，9%，11%）、菌种添加量（1%，1.5%，2%，2.5%，3%)、发酵时间(5 h，6 h，7 h，8 h，9 h)和发酵温度（38℃，40℃，42℃，44℃，46℃）4个因素的不同水平进行单因素试验。

1.3.4 评价方法

（1）感官评价：随机选定10名（男女各半）有经验的品评员组成的感官评分小组。采用加权评分法[11]对产品的感官品质进行综合评定，根据产品组织状态、色泽和风味等3项指标进行感官评价，满分100分。各项指标所占分值及评定标准如表1所示。

（2）酸度测定：按照GB 5009.239-2016《食品酸度的测定》中酚酞指示剂法。

2 结果与分析

2.1 牛羊奶混合比例对牛羊奶混合发酵乳感官评分的影响

图1 牛羊奶混合比例对牛羊奶混合发酵乳感官评分的影响

牛羊奶适宜的混合比例才能赋予发酵乳特有的醇厚风味，稳定的组织状态，以及细腻爽滑的口感。由图1可知，当牛羊奶混合比在3∶1～2∶1范围内，感官评分升高，发酵乳的组织状态越来越稳定，特有的发酵乳风味越发显著；当牛羊奶混合比为2∶1时，发酵乳的感官评分最高，此时呈现明亮的乳白色，酸味醇厚，爽滑适口；而当牛羊奶混合比在1∶1～1∶3范围时，发酵乳凝乳状态较差，羊膻味较强，感官评分下降，因此牛羊奶混合比例固定为2∶1。

2.2 低聚果糖添加量对牛羊奶混合发酵乳综合评分的影响

图2 低聚果糖添加量对牛羊奶混合发酵乳综合评分的影响

表1 牛羊混合酸奶感官评价标准

图3 不同低聚果糖添加量对贮存期牛羊奶混合发酵乳中活菌数的影响

（3）乳酸菌活菌数测定：按照GB 4789.35-2016《食品微生物检验》中M RS平板计数法。

由于低聚果糖自身有一定甜度，添加时需要先将

其与白砂糖复配调节到适当的甜度后，再加入发酵乳中发酵[7]。由图2和图3可知，随着低聚糖添加量的增加，发酵乳的感官评分逐渐升高，而酸度的变化趋势不显著。当低聚糖添加量为1.2%时，发酵乳感官评分达到最高分。通过对不同低聚糖添加量贮存期内牛羊奶混合发酵乳中活菌数的对比，可以明显看出发酵乳在4℃，21 d内，活菌数呈下降趋势，但添加低聚果糖的发酵乳活菌数明显高于对照组，其中添加1.2%低聚果糖的发酵乳在贮藏期一直保持较高的活菌数水平。当低聚果糖添加量过高时，可能是高浓度的低聚果糖在发酵乳中形成了高渗透压，对乳酸菌产生一定的脱水作用而抑制了其生长[12]，因此固定低聚果糖的添加量为1.2%。

2.3 单因素试验结果与分析

2.3.1 蔗糖添加量对牛羊奶混合发酵乳综合评分的影响

图4 蔗糖添加量对牛羊奶混合发酵乳综合评分的影响

在发酵乳生产过程中添加蔗糖不仅可增加乳中干物质含量，而且能有效促进凝乳，缓和酸度，提高口感质量。适宜的蔗糖浓度可以促进乳酸发酵，但是蔗糖浓度过高时将会抑制整个发酵过程[13-14]。由图4可知，随着蔗糖添加量的增加，感官评分也随之升高，当蔗糖添加量为7%时，发酵乳的感官评分最高，酸甜适口，口感最佳。当蔗糖添加量过多时，会造成发酵乳有甜腻感，感官评分也随之降低。

2.3.2 菌种添加量对牛羊奶混合发酵乳综合评分的影响

图5 菌种添加量对牛羊奶混合发酵乳综合评分的影响

由图5可知，菌种添加量对牛羊奶混合发酵乳的感官评分以及酸度影响显著。在牛羊奶混合发酵乳发酵过程中，两菌1∶1混合能有效提高发酵速率，并且

保加利亚乳杆菌的产物对发酵乳的风味有很大的影响[15]。当菌种添加量为2.5%时，发酵乳的感官评分达到最高，此时具有较好的产黏特性以及适宜的酸度，组织状态均匀稳定，口感爽滑细腻，风味醇厚。当菌种添加量小于2.5%时，发酵乳的酸度随菌种添加量的增加而增大，但为了使酸度和黏度达到要求，需要延长发酵时间，费时费力，造成额外损失。当菌种添加过量时，由于发酵初期凝乳较快，导致产酸加快同时凝乳中出现蛋白质脱水收缩现象，致使乳清析出过多，产品组织粗糙，造成发酵乳质量较差。

2.3.3 发酵时间对牛羊奶混合发酵乳综合评分的影响

图6 发酵时间对牛羊奶混合发酵乳综合评分的影响

由图6可知，在发酵过程中，由于奶中蛋白凝聚，使蛋白质的三维网络凝胶形成的程度越来越高，酸度逐渐增大，发酵乳凝固状态也越来越好[16-17]。当发酵时间达到7 h时，发酵乳的组织状态均匀细腻，酸甜比最佳，感官评分最高。随着发酵时间的延长，发酵酸度在达到一定程度后，混合菌继续产酸，部分酪蛋白溶解，使发酵乳中蛋白凝胶体受到破坏，导致黏度降低[18]。并且当发酵时间过长时，乳酸菌过度繁殖，使发酵乳产酸过快，易造成甜酸比失调，组织状态不稳定，乳清析出较多。因此，选择合适的发酵时间可以使发酵乳中的蛋白形成良好的凝胶体，并维持适宜的酸度，获得较好的感官品质。

2.3.4 发酵温度对牛羊奶混合发酵乳综合品质的影响

图7 发酵温度对牛羊奶混合发酵乳综合品质的影响

由图7可知，随着发酵温度的升高，牛羊奶混合发酵乳的感官品质先升高后降低。当发酵温度在38℃～42℃之间，发酵乳的产酸性和凝固性逐渐增强，并在42℃达到最高分，此时发酵乳的口感最佳，混合菌相互促进生长，凝乳状态较好。高于42℃后，由于混合菌产酸性增强，发酵乳酸味过重，凝乳性较差，造成大量乳清析出。因此固定牛羊乳混合发酵乳的培养温度为42℃。

2.4 响应面优化试验

2.4.1 响应面优化方差分析

在单因素实验的基础上以及分析各因素对牛羊奶混合发酵乳发酵工艺影响的大小，采用Box-Behnken中心组合设计原理，以蔗糖添加量、菌种添加量和发酵时间为考察因素，牛羊奶混合发酵乳的感官评分（Y）为响应值，建立数学模型，以获得其最佳发酵工艺条件。响应面试验因素与水平编码、Box-Behnken设计方案及响应值结果和Box-Behnken实验方差分析如表2、表3、表4所示。

表2 响应面试验因素与水平编码

表3 Box-Behnken设计方案及响应值结果

对表3中进行处理，并进行多元回归拟合，获得感官评分(Y)对蔗糖添加量（A）、菌种添加量（B）和发酵时间（C）的二元多项回归的拟合代码方程为：Y=92.24+0.59A+0.17B-0.11C-0.18AB+0.15AC-0.98BC-2.24A2-2.17B2-1.49C2。

对回归模型进行方差分析和显著性检验，结果见表4。该方程的相关系数R2=0.9927，整体模型达到极显著水平（P＜0.0001），失拟项不显著（P=0.1773），说明回归方程对实际情况具有良好的模拟度。回归模型的校正系数R2adj=0.9833，说明98.33%的响应值变化可以用此模型进行有效的解释。各项的P值表明，方程中A、BC、A2、B2、C2对响应值影响显著（P＜0.05），影响大小顺序为：A＞B＞C，即蔗糖添加量对产品的影响最大，其次是菌种添加量，发酵时间对产品的影响力最小。BC的P值小于0.01，说明菌种添加量和发酵时间对产品的影响存在交互作用极显著。

表4 Box-Behnken实验方差分析

2.4.2 响应面分析及工艺优化

图8 各因素交互作用的响应面图

由图8可知，蔗糖添加量、菌种添加量和发酵时间之间均存在一定的交互作用，其中菌种添加量和发酵时间交互作用显著。当菌种添加量为最优值时，发酵时间对感官评分的影响较为显著。而发酵时间缩短或延长时，增加或减少菌种添加量均无法提高感官评分，主要是因为缩短发酵时间，不利于菌种的增殖，发酵乳无法达到最佳的酸度及风味。而延长发酵时间，致使发酵乳中蛋白凝胶体受到破坏,导致黏度降低，又因乳酸菌过度繁殖,使发酵乳产酸过快，易造成甜酸比失调，组织状态不稳定，乳清析出较多，导致感官评分下降。

2.4.3 最佳工艺条件的验证

利用Design Expert V8.0.6软件进行分析，得到牛羊奶混合发酵乳的最佳工艺参数为：蔗糖添加量为7.26%，菌种添加量为2.52%，发酵时间为6.95 h。为了验证回归模型的可靠性，同时考虑实际操作的可行性，对最佳工艺参数适当调整，即:蔗糖添加量为7.3%，菌种添加量为2.5%，发酵时间为7 h。并按此工艺进行3次平行试验，得到发酵乳的感官评分为92.2分，与预测值92.3较为接近，表明该模型的拟合程度较高，并且在4℃条件下贮藏21 d后，发酵乳最大活菌数为7.7×107cfu/m L。

3 结论

研究确定了牛羊奶混合发酵乳中牛羊奶最佳混合比例为2∶1，低聚果糖添加量为1.2%，发酵温度为42℃，并通过单因素试验确定了发酵时间、蔗糖添加量和菌种添加量的水平，经过Design-Expert.V8.0.6进行响应面试验优化牛羊奶混合发酵乳的最佳工艺配方为：蔗糖添加量为7.3%，菌种添加量为2.5%，发酵时间为7 h。在此条件下制备的酸奶口感醇厚，酸甜适口，风味独特。在4℃条件下贮藏21 d后，发酵乳最大活菌数为7.7×107cfu/m L，为工业化生产高活菌型发酵乳提供技术支持，也为羊奶资源的开发利用拓宽了发展渠道。