高效薄层色谱-气相色谱-四级杆质谱法检测母乳中脂肪酸分布

方景泉，迟涛，孙广梅，张钋，徐晓娟，刘芝荣

(1．国家乳业工程技术研究中心黑龙江省绿色食品科学研究院，哈尔滨150028；2．东北农业大学乳品科学教育部重点实验室食品学院，哈尔滨150030)

0 引 言

母乳是人类为哺育后代而分泌的乳汁，是婴儿阶段营养最完备的食物，母乳中的脂肪酸组成和分布对婴儿后天健康等各个方面具有重要影响[1]。母乳中的脂肪酸主要由甘油三酯、甘油磷脂和游离脂肪酸组成。测定婴儿母乳中的脂肪酸具有重要意义，不仅可以指导母乳代用品的研制和开发(如中国每年约有960万婴儿需要补充母乳代用品)，而且，因为母乳中脂肪酸组成与膳食脂肪酸组成相关[2]，可以通过改善哺乳母亲膳食改变母乳脂肪酸的组成，如多不饱和脂肪酸所占比例，满足婴儿生长发育需求。

母乳中的脂肪酸的测定已经有很多报道，常采用有机溶剂提取、甲酯化后经气相色谱(gas chromatography,GC)分析[3-5]，但这种方法无法获得脂肪酸在甘油三酯、甘油酯等酯中的分布信息。也有一些文献采用高效液相色谱质谱(high performance liquid chromatography-mass chromatography,HPLC-MS)分析脂肪酸，可以获得结构信息，但分析成本过高，不利于大规模筛查测定。母乳样品量较少(约为20 m L)还要测定多个参数，因此在测定脂肪酸时在保证检出度的情况下，尽量选择较少的样本量，所以其他柱层析等方法也不适用。

薄层色谱(thin-layer-chromatography,TLC)是上个世纪50年代应用较多分离极性和非极性成分的技术[6-8]，近年来，通过改善薄层色谱的制备及操作方法，形成采用高效薄层色谱(high performance thin layer chromatography,HPTLC)和二维薄层色谱(two dimention thin layer chromatography,TDTLC)分离如脂质等极性和非极性成分的方法[9]，在样品的前处理方面显示出明显的优越性[10]。目前联用高效薄层色谱-气相色谱-四级杆质谱检测人母乳中脂肪酸的研究尚未见报道。本研究建立了定性定量分析人母乳中脂肪酸初级结构和成分的高效薄层色谱-气相色谱-四级杆质谱联用分析方法，获得了人母乳脂肪酸成分的分布和结构信息。

1 实 验

1.1 仪器、试剂及耗材

分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；离心机(上海安亭科学仪器厂)；氮吹仪(奥特赛思仪器有限公司)；紫外可见投射反射仪(上海精科实业有限公司)；7890气相色谱配5975质谱(美国安捷伦公司)。

37种混合脂肪酸甲酯标准品(Sigma公司)；甲醇和正己烷(HPLC级，Fisher公司)；显色剂2,7-二氯荧光素(梯希爱化成工业发展有限公司)；GF254高效薄层色谱板(青岛海洋化工厂)；13%～15%三氟化硼甲醇溶液(上海安谱科学仪器有限公司)；氮气、氦气、空气及氢气(哈尔滨黎明气体有限公司)。所用试剂除特别标明外，均为分析纯。

样品：中国东北地区，1-12周泌乳期母乳。

1.2 色谱-质谱条件

色谱柱：SP-2560(100 m×0.25 mm ID 0.20μm)(Sigma公司)。进样口温度240℃；恒流速模式；进样量1μL；分流比50∶1；程序升温：140℃(保留5m in)，5℃/m in升至180℃ (保留10 min)，2℃/m in升至210℃(保留15 min)，10℃/m in升至240℃(保留8 min)，共64 min；FID检测器温度250℃；离子源温度：230℃；四级杆温度：150℃；接口温度210℃；溶剂延迟：9.5m in。

1.3 甘油酯和甘油磷脂的分离

样品冻藏：采集的样品分装成5 m L离心管内，于-80℃冷冻保藏，在保存30 d内解冻进行脂肪酸分析。

脂肪提取：称取试样1.0 g至10 m L试管中，加入0.2 m L氨水，于65℃±1℃水浴锅中放置15 min，取出轻摇，冷至室温。在制备好的样品中加入1 m L乙醇，混匀。加入2.0 m L乙醚，加塞振摇1 min。加入2.0m L石油醚，加塞振摇1 min，静置、分层，有机层转入10 m L螺口玻璃管中。再加入2.0 m L乙醚及2.0m L石油醚，加塞振摇1 min，静置、分层，有机层转入螺口玻璃管，加1.0m L乙醚及1.0m L石油醚再重复操作一次。合并抽提液于螺口玻璃管中，氮吹干。得浓缩物。

甘油酯分离：向上述浓缩物中加入100μL三氯甲烷，用1 m L注射器吸取点样，把点好样的硅胶板放入层析缸中，缓慢充入氮气10 min，然后盖严层析缸。等到层析液沿硅胶板上升到顶部时，取出硅胶板。氮气保护晾干，在硅胶板上方喷洒显色剂0.1%2,7-二氯荧光黄显色，在紫外灯365 nm下照射下观察。用铅笔画出各个条带的范围。上部明亮区是甘油三酯，下部明亮区是甘油二酯，中间细微明亮的地方是游离脂肪酸，最下部分为甘油一酯。

甘油磷脂分离：将上述浓缩物用1 m L三氯甲烷溶解，把溶液注入硅胶柱中，用0.5 m L三氯甲烷清洗2～3次，洗液并入硅胶柱，用10m L三氯甲烷洗脱非甘油磷脂成分，再用12 m L甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，用氮气吹干，得到甘油磷脂。

1.4 脂肪酸甲酯化处理

在提取的母乳脂肪浓缩物中加入0.1m L焦性没食子酸甲醇溶液。氮吹浓缩干燥，加入1m L氢氧化钾甲醇溶液置于80℃±1℃水浴上回流5～10 min。再加入0.5 m L三氟化硼甲醇溶液，继续回流15 min，冷却至室温，将磨口玻璃管中的液体移入10m L离心管中，分别用0.3 m L饱和氯化钠溶液清洗磨口玻璃管三次，合并饱和氯化钠溶液于10 m L离心管，加入1 m L正己烷，振摇后，以5 000 r/m in离心5 min，取上清液作为试液，供气相色谱仪测定。

1.5 样品储藏稳定性试验

样品采集后，投入液氮中，运回实验室后，将同一母乳样品分成30份分别储藏在-20℃和-80℃冰箱内进行储藏时间试验，每隔6 d取样一次。外标法测定总脂肪中多不饱和脂肪酸DHA(docosahexaenoic acid,DHA)、花生四烯酸(arachidonic acid,ARA)的质量分数，直至数据具有显著性差异，为最长保存时间。

2 结果与讨论

2.1 样品储藏及取样量

母乳样品的储藏方式直接决定样品中脂肪及脂肪酸的稳定性，本研究通过比较DHA、ARA脂肪酸在储存期间质量浓度的变化，对质量浓度按照时间顺序进行显著性分析。结果表明，储藏在-20℃的样品，测定到第36 d时，ARA质量分数从0.39%显著性减少至0.34%；DHA、质量分数从0.37%显著性减少至0.30%。储藏在-80℃的样品，测定到第72 d时，ARA质量分数从0.39%显著性减少至0.33%；DHA、质量分数从0.37%显著性减少至0.31%。储藏温度对脂肪酸的影响结果这与Lacom ba等[11]的研究结果类似，变化范围与Yuhas等[3]的研究结果类似。因此，短时间能够测定的样品储存在-20℃冰箱中，长期保存样品储存在-80℃冰箱中。

因母乳样品有限，测定时要尽量使用较少的样品进行检测。每个地区随机取12个样品，一开始称样量为5.00 g，随后不断减少样品称样质量，以脂肪质量百分比2.0%和检出限2倍为最低称样量。最终确定最低称样质量为1.06±0.16 g。

2.2 色谱条件优化

2.2.1 薄层色谱分离条件优化

TLC是将脂类在层析缸内用展开剂把各组分在硅胶板上进行展开，根据各组分的极性和硅胶的吸附能力各不相同，将组分在硅胶板上分离开。展开液的极性组成及硅胶板的厚度决定了甘油三酯、甘油二酯、游离脂肪酸、甘油一酯的分离程度。硅胶板选择0.25 mm及0.35 mm两种。0.35 mm的薄层板硅胶层太厚，样品分离时间长，分离条带不够清楚。因此选用0.25 mm厚度的硅胶板作为分离板。在展开液优化中，将乙醚的量逐渐加大，直至各条带明显分开。图1显示了展开液优化前后的对比。展开液组成为正己烷、乙醚和冰醋酸(体积代为70∶30∶1)时，效果较好，甘油三酯、甘油二酯、游离脂肪酸、甘油一酯清晰可见且分布均匀。紫外灯波长选择365 nm和254 m n同时照射效果较好，这与Zaim a[12]等采用的双波长方法一致。

4.执法人员的综合素养有待提高。作为落实“谁执法谁普法”责任制的直接责任人，执法人员的专业素质和法治素养直接决定了“谁执法谁普法”的工作实效。落实“谁执法谁普法”责任制，对一线的执法人员提出了更高的要求，不仅专业要过硬，更要有良好的法治素养。调研中发现，部分执法人员专业业务过硬，但法治素养较弱，运用法治思维与法治方式解决问题的能力还不够强，在面对群众释法说理上存在一定的短板。

本研究为增加脂肪酸的检出率，并没有采用通常的点状点样法，而是采用条形点样法。将常用的尖头点样针磨平，点上焊锡后磨圆，形成圆形的点样针头，防止将硅胶层划破，导致样品迁移速度不一致。点样时在距离薄层板短边1.5 cm处均匀加载样品，边加载样品，边用氮气吹干，可反复多次，直至将100μL全部加载到薄层板上。

图1 展开液优化前1-a和展开液优化后1-b对比

在高效薄层色谱展开时，向展开缸内缓缓通入氮气后盖严，用于保护多不饱和脂肪酸，尤其是游离脂肪酸中含有的多不饱和脂肪酸避免氧化，并使测定结果稳定。游离脂肪酸的空间折叠结构使双键暴露在外，如不进行氮气保护展开和晾干，很难在游离脂肪酸中测出多不饱和脂肪酸。与甘油结合的脂肪酸，虽然部分双键暴露在外，但极性较小，容易溶于有机溶剂而受到保护。

2.2.2 质谱扫描质量范围的确定

为了对人母乳中所有可能存在的脂肪酸进行识别和检测，采用全扫描模式进行分析。由于有些色谱峰小且狭窄，我们采用了仪器所能提供的较高的扫描频率。

母乳中短链脂肪酸特征离子从55.1开始，集中在55～150的范围内，中链脂肪酸范围从55～250，长链脂肪酸从55～300，最后都有一个472的特征离子。样品中出峰的特征离子范围大多在55～200之间。因此质量扫描范围的起始值定位50。母乳中目前发现的脂肪酸的最大碳原子数是24，选择500为最大质荷比。在上述质量扫描范围内，扫描速率为20 000 am u/s，扫描频率约为35 H z。上述质谱参数与其他研究者脂肪酸质谱测定参数类似[13-14]，能够满足所有脂肪酸的定性定量分析。图2是37种脂肪酸的质谱图。37种脂肪酸分离效果良好，只有一种顺反异构脂肪酸分离度为0.8，其他脂肪酸分离度均大于1。图3是泌乳期25 d的样品的谱图，25 d时，母乳中脂肪酸的种类最多且达到平衡。从图中可以看出，所有峰分离度均大于1。含量较低的月桂酸也得到检出。

图2 37种脂肪酸标准谱图

图3 泌乳期25天样品谱图

37种脂肪酸特征离子见表1。使用了特征离子定性，从图3可以看出，即使分离度稍差，也能得到很好的定性。定量时，并没有使用所有特征离子作为定量离子，部分脂肪酸没有获得稳定的定量离子，没有获得稳定定量离子脂肪酸，将采用内标法进行定量。但因为质谱定量的局限性，对于某些需要确认准确含量的脂肪酸，采用FID检测器精确定量。

2.3 检出限与定量下限

分别准确称取22.2、26.0、19.0、21.0、16.0、24.0的亚麻酸、亚油酸、棕榈酸、油酸、肉豆蔻算和硬脂酸，配置标准曲线，按照浓度由低到高的顺序分别对标准混合液进行测定，并将测得的ELSD峰面积Y与其标准溶液的质量浓度（x，mg/L)进行线性回归分析，得到6种高级脂肪酸的标准曲线方程。选择合适的最低浓度的标准溶液平行测定10次，计算其标准偏差，以3倍标准偏差为测定的检出限，10倍标准偏差为测定的定量下限。结果显示，该方法具有线性范围宽、检出限低的特点。

表1 37种脂肪酸的特征离子

2.4 方法的精密度与回收率

选定母乳样品，优化条件下平行测定7次以下项目，计算回收率，测试结果和方法的精密度。采用标准加入法，将DHA、EPA、亚油酸、α-亚麻酸和γ亚麻酸5种脂肪酸的标准工作液加入到母乳样品中，将加标和未加标的母乳样品按照选定的样品处理方法进行处理后，采用优化的方法进行分析。根据各种高级脂肪酸在加标和未加标样品中的测定量以及加入标准品的含量计算该方法的回收率，结果列于表2。从表2可知，各脂肪酸测定结果的相对标准偏差在4.9%～13.5%之间，加标回收率在83%～104%之间，表明本方法有较好的重复性和准确度，满足母乳样品中脂肪酸的定量要求。

表2 方法回收率和精密度(n=5)

2.5 样品分析

本研究选择东北地区36份母乳样品进行定性定量分析，取其中5位母亲混合母乳的泌乳期7、12、25、30母乳样品进行总脂肪酸、甘油三酯、甘油二酯、甘油磷脂中的脂肪酸组成及分布的测定。表3是泌乳7天时脂肪酸的分布图。从表中可以看出，泌乳初期，无游离脂肪酸，而且初期脂肪酸种类较少。甘油三酯、甘油二酯、甘油磷脂中的脂肪酸与总脂肪酸并非一一对应，可能是在总脂肪酸提取的时候，由于衍生温度等条件、脂肪酸种类等不同，导致一些脂肪酸未甲酯化或未测出。甘油三酯、甘油二酯、甘油磷脂中的脂肪酸种类大于总脂肪酸，说明本方法相比直接测定总脂肪酸，能够获得更为丰富的脂肪酸分布信息。

另外，甘油三酯中脂肪酸分布较广，与总脂肪酸分布类似，这是因为母乳中脂肪95%均为甘油三酯[15]。甘油二酯中的脂肪酸主要是中长链脂肪酸。甘油一酯中脂肪酸是长链和短链脂肪酸，甘油磷脂中主要是中长链脂肪酸，其中不饱和脂肪酸所占比例较大。随着泌乳期的变化，各甘油酯中的脂肪酸组成也不断变化，这泌乳期内饮食的变化直接相关，但是有一些脂肪酸发生变化很少。这些很少发生变化的脂肪酸可能对于婴儿健康和乳汁组成具有重要作用。需要通过此测定方法进一步研究。

3 结论

本研究建立了人母乳中总脂肪酸、甘油三酯、甘油二酯、甘油磷脂中脂肪酸分布的高效薄层色谱-气相色谱-质谱分析方法。方法的主要脂肪酸的检出限范围为2.1～2.4 m g/L，回收率在83%～104%之间，满足测定要求。通过该方法测定了人母乳样品的脂肪酸相比直接测定总脂肪酸，能够获得更为丰富的脂肪酸分布信息。

表3 泌乳7d时脂肪酸的含量