畜禽粪肥添加及干湿交替强度对土壤微生物功能多样性的影响

李江涛，罗甜甜，杜满聪，倪 杰，龚建周

（广州大学地理科学学院，广东 广州 510006）

有机肥管理和水分管理是农业生产的重要管理措施[1-2]。一直以来有机肥都是我国农业生产中的主要肥源之一，它含有多种作物可被吸收利用的微量元素和有机物，以及有益微生物和各种活性酶，在保持、改善和提高土壤肥力、活化土壤养分、增强微生物活性、促进农作物高产、优质以及降低农产品成本等方面有着不可替代的作用[3-4]。许多研究表明，与不施肥和施用化肥比较，施用有机肥能够显著提高土壤有机质含量，明显改善土壤孔隙状况、以及土壤团聚作用[5-7]。另外，有机肥也是控制土壤微生物生物量活性和多样性的关键因素[8]。施用有机肥既能够显著提高土壤中碳源的数量和种类，也可以显著地增加了多种养分，从而明显改变土壤微生物群落的生物活性和多样性[7，9-10]。然而随着集约化、规模化现代养殖业的出现，现代集约化畜禽有机粪肥对农业土壤生态系统的影响受到质疑，甚至成为农田污染物的重要来源之一。因此，进一步关注现代集约化畜禽粪肥施用影响具有重要意义。

干湿交替循环是农业土壤上非常自然的过程，降雨或者农业灌溉能够迅速湿润土壤，而重力排水和自然蒸发作用土壤又会逐渐变得干燥[11]。干湿交替过程是土壤水势迅速变化的过程，土壤水势的快速变化极易导致土壤中不适应环境变化的微生物死亡或者失去活性[12]，因此干湿交替循环能够影响土壤微生物生物量数量和活性[13]。干湿交替不仅影响了土壤微生物生物量活性，也能够改变土壤微生物群落的组成[14]。

本研究通过探讨添加不同畜禽粪肥及其干湿交替强度变化如何影响土壤微生物群落功能多样性，旨在为畜禽粪肥农业利用提高进一步的数据支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试土壤于2011年采自于江苏省海安县长期施用化肥的稻麦轮作土壤的犁底层（15～25 cm），土壤类型为河流沉积相发育而成的潮土基础上形成的水稻土。试验前仔细去除土壤样品中的根系、石砾和动植物残体，全部通过2 mm土壤筛后，自然风干备用。供试土壤有机碳含量为8.55 g/kg，全氮、全磷和全钾含量分别为0.92、0.63、15.87 g/kg，土壤pH值为6.85，土壤容重为1.44 g/cm3，土壤粘粒、粉粒和砂粒含量分别为83.39、201.21、715.40 g/kg。土壤微生物碳、氮含量分别为274.78、23.15 mg/kg，土壤基础呼吸速率为17.53 mg/kg·d （CO2-C）。

1.2 试验方法

试验前将供试土壤含水量调节至60%田间持水量，并将供试土壤置于25℃的培养室中预培养1周，以促进风干供试土壤中的微生物群落的恢复。预培养结束后，将已经制备好的猪粪和鸡粪等两种畜禽粪肥干样品按干重2%的量分别添加到预培养土壤中，混合均匀。

试验设添加鸡粪肥（CM）、猪粪肥（PM）和不添加粪肥（CK）3个处理。同时设置3个干湿交替强度处理：（1）60%田间持水量恒定培养（CWC）；（2）弱干湿交替处理（LWD），土壤样品饱和湿润24 h后，干燥1周使土壤含水量回到60%～80%田间持水量；（3）强干湿交替处理（SWD），土壤样品饱和湿润24 h后，干燥1周使土壤含水量低于8%（约为-1.5 MPa下土壤含水量）。整个培养试验干湿交替周期为4次，解除干湿交替胁迫后将土壤含水量调节至田间持水量60%左右持续培养1周后完成培养试验。培养试验结束后，破坏性采集土壤样品，立即测定土壤微生物功能多样性。

1.3 土壤微生物功能多样性测定方法

土壤微生物功能多样性采用美国BIOLOG公司生产的ECO微孔板测定。具体方法为：称取相当于5 g干土重的新鲜土壤样品加入到 45 mL 0.85%生理盐水中，恒温震荡 30 min取出静置 10 min后，吸取土壤上清液 1 mL到 9 mL的培养管中，将稀释液接种到ECO微孔板上，每孔接入量为 125 μL。接种后每间隔12 h在590 nm处测定各孔的吸光值（OD）。每孔平均颜色变化率（AWCD）、香农指数（H′）、辛普森指数（D）以及 McIntoch 指数（U）等土壤微生物群落功能多样性计算公式如下：

式中，C表示各孔溶度的吸光值，R表示A1未加碳源对照孔的吸光值，n表示碳源的种类香，M为反应孔溶液吸光值总和，Pi表示第i 孔溶液相对吸光值与M的比率，mi为第i孔溶液相对吸光值 （C - R）。

1.4 数据处理与统计分析

采用SPSS19.0软件对试验数据进行方差分析、相关分析、主成分分析、聚类分析和对应分析；差异显著性采用LSD等方法进行检验，采用Origin 8.5软件绘图。

2 结果与分析

2.1 畜禽粪肥添加及干湿交替强度处理土壤的平均颜色变化率

由图1可知，无添加畜禽粪肥对照土壤微孔板中每孔的平均颜色变化率（AWCD）很低，平均值仅为0.09，而添加鸡粪肥和猪粪肥处理土壤其AWCD值分别为对照的4.5倍和5.9 倍，极显著高于对照土壤。干湿交替明显改变了AWCD值，恒定含水量下培养土壤的AWCD值最低；弱干湿交替胁迫显著提高了对照和添加鸡粪肥处理土壤AWCD值，但对添加猪粪肥处理土壤没有明显影响。对照AWCD值没有受强干湿交替胁迫的影响，但强干湿交替能显著改善添加畜禽粪肥土壤AWCD值（图1A）。

BIOLOG微孔板中A1孔没有添加碳源，其OD值的变化和大小代表着土壤微生物群落活性。由图1B可知，AWCD值随着A1孔OD值的增大成指数型增长（r = 0.91，P＜ 0.01）。

图1 畜禽粪肥添加及干湿交替培养对AWCD的影响（A）及A1孔OD值与各孔AWCD的关系（B）

2.2 畜禽粪肥添加及干湿交替强度处理土壤微生物群落碳源利用动态

图2显示了畜禽粪肥添加和干湿交替培养后土壤微生物群落对ECO微孔板中31种碳源的平均利用率。由图2可知，无添加对照土壤微生物群落利用碳源能力最弱，AWCD均值低于0.6；与对照比较，添加畜禽粪肥均能明显提高土壤微生物对碳源的利用能力。

干湿交替胁迫强度能明显改变土壤微生物群落对碳源的利用能力（图2）。与恒定含水量培养条件比较，干湿交替胁迫均显著提高了对照和添加鸡粪肥处理土壤中微生物群落对碳源的平均利用能力（图2A、B）；干湿交替胁迫后添加猪粪肥土壤对碳源利用能力表现为前期促进而后期有抑制作用（图2C）。

由图3可知，对照土壤微生物群落对胺类碳源利用率非常低，胺类碳源几乎没有被微生物利用；畜禽粪肥的添加显著提高了土壤微生物对胺类碳源的利用能力，而猪粪肥的效果明显好于鸡粪肥的添加。干湿交替培养对土壤微生物群落利用胺类碳源的利用能力产生了影响，但主要表现在添加鸡粪肥土壤上，对添加猪粪肥土壤影响甚微。

图2 畜禽粪肥添加及干湿交替强度处理对所有碳源利用率的影响

图3 畜禽粪肥添加及干湿交替强度处理对胺类碳源利用率的影响

从图4可以看出，对照土壤微生物群落对氨基酸类碳源利用率较低，仅为添加畜禽粪肥土壤AWCD均值的1/2左右；与添加猪粪肥比较，鸡粪肥添加对土壤AWCD值有一定程度的提高。干湿交替强度能明显提高土壤微生物群落对氨基酸类碳源的利用能力，其中在添加鸡粪肥处理土壤上表现最为明显。

图4 畜禽粪肥添加及干湿交替强度处理对氨基酸类碳源利用率的影响

由图5可知，添加畜禽粪肥显著提高了土壤中微生物群落对碳水化合物类碳源的利用能力，添加鸡粪肥和猪粪肥处理土壤AWCD值均为无添加对照土壤的3倍以上。干湿交替强度处理也能明显影响土壤微生物群落对碳水化合物类碳源的利用能力，但主要表现在添加畜禽粪肥处理土壤上，其中在添加鸡粪肥土壤上，干湿交替处理AWCD值明显高于恒定含水量培养处理土壤。干湿交替强度对无添加对照土壤微生物利用碳水化合物类碳源的利用影响较小。

与添加畜禽粪肥土壤比较，对照土壤微生物群落对聚合物类碳源利用能力最低（图6）。干湿交替显著地改变了土壤微生物对聚合物类碳源的利用能力。在对照土壤上，弱干湿交替能激活土壤微生物对聚合物类碳源的利用，AWCD值表现为最大（图6A）；在添加鸡粪肥土壤上，干湿交替均能显著改善土壤微生物群落对聚合物类碳源的利用，但强干湿交替处理极显著地促进了微生物群落对聚合物类碳源的利用（图6B）；然而在添加猪粪肥土壤上，强干湿交替处理培养前期AWCD最高，但84 h后该处理土壤微生物群落对聚合物碳源的持续利用能力明显下降（图6C）。

图5 畜禽粪肥添加及干湿交替强度处理对碳水化合物类碳源利用率的影响

图6 畜禽粪肥添加及干湿交替强度处理对聚合物类碳源利用率的影响

与对其他碳源利用情况比较，土壤微生物对羧酸类和其他杂类碳源利用能力偏低。但是添加畜禽粪肥还是促进了土壤微生物对该类碳源的利用，添加鸡粪肥和猪粪肥土壤AWCD值均高于对照（图7、图8）。

2.3 畜禽粪肥添加及干湿交替强度处理土壤微生物群落功能多样性指数

由表1可知，对照土壤的丰富度较低，平均仅为4.11，畜禽粪肥添加明显提高了土壤微生物群落丰富度，添加鸡粪肥和猪粪肥土壤微生物丰富度指数分别为15.00和19.67，为对照土壤的3.65倍和4.78倍。干湿交替培养能明显提高土壤微生物种群丰富度，除添加猪粪肥土壤弱干湿培养土壤外，干湿交替培养土壤丰富度均显著高于恒定含水量培养土壤。

辛普森（Simpson）多样性指数通常用来评价某些常见种的优势度。从表1可以看出，添加畜禽粪肥有利于土壤微生物 Simpson多样性指数的提高，与对照比较，添加鸡粪肥和猪粪肥土壤辛普森指数分别提高124.56%和164.29%。干湿交替过程对土壤微生物辛普森指数有明显改善作用，所有处理均达到显著水平。

多样性包括利用基质的丰富度和均匀度两个方面，香农指数（Shannon）同时包含了基质利用丰富度和均匀度的信息。表1结果显示，添加畜禽粪肥显著提高了土壤微生物功能多样性Shannon指数和均匀度；干湿交替处理对添加畜禽粪肥土壤Shannon多样性指数和均匀度也有明显改善作用。

图7 畜禽粪肥添加及干湿交替强度处理对羧酸类碳源利用率的影响

图8 畜禽粪肥添加及干湿交替强度处理对其他杂类碳源利用率的影响

表1 畜禽粪肥添加及干湿交替强度处理对土壤微生物功能多样性指数的影响（60 h）

McIntoch多样性指数常用于评价微生物群落物种均一性，也同时包含了基质利用丰富度和均匀度的信息。与未添加畜禽粪肥比较，添加鸡粪肥和猪粪肥显著地提高了土壤微生物群落McIntoch多样性指数；干湿交替培养对土壤微生物功能McIntoch多样性指数也产生明显的正效应。但是畜禽粪肥添加对土壤微生物McIntoch均匀度没有明显影响，而干湿交替培养对McIntoch均匀度的影响也仅表现在添加猪粪肥处理，但差异较小（表1）。

2.4 土壤微生物群落功能多样性差异分析

分别利用因子分析（图9）和聚类分析（图10）对畜禽粪肥添加和干湿交替培养对土壤微生物群落功能多样性影响因素进行分析。因子分析和聚类分析结果一致表明，添加畜禽粪肥是导致土壤微生物群落功能多样性改变的主要因子，其次为干湿交替强度，不同畜禽粪肥间也有一定的影响。

图9 畜禽粪肥添加及干湿交替培养对土壤微生物群落功能多样性因子分析

图10 畜禽粪肥添加及干湿交替培养对土壤微生物群落功能多样性聚类分析

由于畜禽粪肥的添加和干湿交替培养作用，土壤微生物群落对6类31种碳源的利用产生了明显的改变。因子分析结果（图11）表明，对土壤微生物群落功能多样性产生明显影响的第一主要影响碳源13种，分属于5类碳源：（1）碳水化合物类碳源，有β-甲基-D-葡萄糖苷（A2）、D-木糖/戊醛糖（B2）、D-甘露醇（D2）、N-乙酰-D葡萄糖氨（E2）、D-纤维二糖（G1）；（2）聚合物类碳源，包括吐温40（C1）、吐温 80（D1）；（3）羧酸类碳源，有D-半乳糖醛酸（B3）、D-苹果酸（H3）；（4）氨基酸类碳源，包括L-天门冬酰胺（B4）、L-苯丙氨酸（C4）；（5）其他类碳源，有1-磷酸葡萄糖（G2）、D，L-α-磷酸甘油（H2）；第二主要影响碳源有4种，D-葡糖胺酸（F2）和苯乙胺（G4）分属羧酸类和胺类，L-精氨酸（A4）和L-丝氨酸（D4）则属于氨基酸类；第三主要影响碳源有2种为氨基酸类碳源的L-苏氨酸（E4）和甘氨酰-L-谷氨酸（F4）。由此可见，碳水化合物类和氨基酸类碳源是影响土壤微生物功能多样性的主要碳源。

聚类分析结果（图12）表明，影响微生物功能多样性6类碳源可以分为三大类，一是以氨基酸类为主包括聚合物类、羧酸类和其他杂类碳源；二是碳水化合物类碳源；三是胺类碳源。由于ECO板中胺类碳源仅有2种，因此，影响土壤微生物功能多样性碳源主要为两类，碳水化合物类和氨基酸代表类，与因子分析结果一致。

为了进一步了解畜禽粪肥添加和干湿交替培养分别主要影响土壤微生物群落对特别碳源的利用，我们对不同处理和31种碳源进行了对应分析。分析结果（图13）显示，不同添加畜禽粪肥和干湿交替培养土壤得到了较好的分开，第1象限为添加鸡粪肥干湿交替培养土壤，其主要利用吐温 40（C1）、i-赤藓糖醇（C2）、2-羟基苯甲酸（C3）、D-木糖/戊醛糖（B2）、D-半乳糖醛酸（B3）、γ-羟丁酸（E3）、L-苏氨酸（E4）、衣康酸（F3）、甘氨酰-L-谷氨酸（F4）、β-甲基-D-葡萄糖苷（A2）和D，L-α-磷酸甘油（H2）等碳源；第4象限为添加猪粪肥培养土壤，其主要利用α-环式糊精（E1）、D-葡糖胺酸（F2）、α-D-乳糖（H1）、L-精氨酸（A4）、苯乙胺（G4）、4-羟基苯甲酸（D3）和D-半乳糖酸γ-内酯（A3）等碳源；第2和第3象限主要包括对照土壤和恒定含水量培养土壤，主要利用的碳源较少有α-丁酮酸（G3）、4-羟基苯甲酸（D3）、丙酮酸甲酯（B1）、肝糖（F1）等碳源。

图11 畜禽粪肥添加及干湿交替培养对6类碳源的利用分析

图12 影响微生物功能多样性6类碳源的聚类分析

3 结论与讨论

图13 畜禽粪肥添加及干湿交替强度处理与6类碳源利用的对应分析

土壤微生物群落是土壤质量和功能的关键组成[15]。通过了解土壤微生物群落活性、组成和功能多样性有助于我们更好地了解和调控生态功能，因为生态系统抵抗外界严重扰动的能力部分地取决于生态系统内部微生物组成部分[16]。土壤生物在土壤碳循环、有机物的分解和土壤肥力的保持等方面起着非常关键的作用，因此，保持和提高土壤微生物多样性是非常必要的。BIOLOG微孔板中的碳源代表一系列复合物可以用于估计土壤微生物代谢功能多样性的相对潜力[17]。平均颜色变化反映了Biolog微孔板中土壤微生物对单一碳源的氧化利用能力，可以作为反映土壤微生物活性和群落功能多样性的指标[18]。

许多研究表明，施用有机物料能够刺激土壤微生物群落的生长。本研究结果表明，与未添加畜禽粪肥土壤比较，畜禽粪肥的添加显著地增加了AWCD值，也显著提高了土壤微生物群落丰富度、辛普森指数以及香农指数。说明添加畜禽粪肥刺激了土壤微生物群落的生长、提高了微生物活性，也提高了土壤微生物群落的功能多样性。Gomez等[19]研究发现添加有机肥显著提高了土壤微生物AWCD和香农指数。Wada等[20]研究表明施用农家肥后土壤微生物多样性明显提高。Perucci[21]和 Marinari等[22]通过测定脱氢酶活性来表征土壤微生物多样性，结果表明施用堆肥能显著地提高土壤微生物多样性。畜禽粪肥的添加之所以能够提高土壤微生物活性及功能多样性可能与畜禽粪肥施用增加了土壤活性有机质含量和提高了微生物基质的有效性，从而刺激了不同微生物生物量生长，而畜禽粪肥的不同种类则影响土壤微生物群落结构的组成。另外本试验在干湿交替胁迫解除之后，土壤均在60%～80%的田间持水量条件下进行了为期7 d的恒温培养。适宜的生存环境以及干燥过程死亡的微生物、微生物释放的胞内活性基质养分、土壤胶体的分解以及有机质暴露为存活和休眠微生物提供了充足的碳源和能量，使得干湿交替培养处理土壤微生物群落生物量、活性和群落功能多样性显著提高。

本研究结果表明，干湿交替能显著地改变土壤微生物功能多样性。与恒定含水量培养土壤比较，干湿交替培养土壤显著提高了AWCD、群落丰富度、辛普森指数以及香农指数，并且有随着干湿交替强度增加而提高的趋势。干湿交替是通过改变土壤水势来对土壤微生物产生胁迫的[12]。土壤水势的快速变化导致土壤中不适应环境变化微生物死亡或者失去活性，而通过自身调整经受住了湿交替胁迫的土壤微生物得以存活并保持活性，从而可能影响土壤微生物生物量数量和组成[23]。这些在干湿交替过程中得以存活下来的土壤微生物群落，可能对土壤中某些碳源具有优先利用的偏好，从而使得土壤微生物群落表现出对碳源的利用能力的差异[24]，另外对土壤中碳源利用能力的变化也可能是土壤微生物群落对干湿交替环境的变化的一种适应。畜禽粪肥的差异也影响了土壤微生物群落适应干湿交替胁迫的能力[25]。干湿交替胁迫后，添加鸡粪和猪粪肥土壤微生物群落功能多样性明显提高。畜禽粪肥中有机和无机养分的差异可能是改变土壤微生物群落适应干湿交替胁迫能力的重要原因，养分元素的差异能够影响微生物对养分的吸收和利用，从而改变土壤微生物细胞壁组成和体内的渗透压[10]，影响其应对干湿交替胁迫的适应能力。

总之，添加畜禽粪肥能够显著改善土壤微生物群落功能多样性，微生物碳源利用能力提高了4～5倍，添加畜禽粪肥处理土壤微生物多样性指数均明显高于对照土壤。干湿交替强度对微生物群落功能多样性也产生了明显的影响。因子分析和聚类分析结果显示，添加畜禽粪肥是土壤微生物群落功能多样变化的主控因子，而干湿交替胁迫是第二控制因子。添加畜禽粪肥主要是通过改变土壤中碳水化合物和氨基酸类碳源来影响土壤微生物群落功能多样性，而干湿交替主要是通过调整微生物群落来影响其功能多样性。